李 静 张梦珂 米娜娃尔·玉努斯 叶力夏提·阿德力别克
硫酸吲哚酚(indophenol sulfate，IS)是肾脏终末期产生的一种尿毒症毒素。它与白蛋白的结合率超过90%，在血液透析时很难被滤过[1]。因此大量IS在体内蓄积，对人体产生危害。目前，越来越多的研究证实慢性肾脏病终末期肾衰竭尿毒症毒素与心血管疾病存在相关性[2～4]。其中，IS是研究最广泛的尿毒症毒素，它的相对分子质量是251.3，主要来源于色氨酸代谢。色氨酸在肠道细菌的作用下生成吲哚，吲哚被吸收入血后经门静脉进入肝脏，在肝脏中经过羟化、硫酸化以后生成IS[5]。p53是一种调节转录的序列特异性DNA结合蛋白，p53的功能集中在其促进细胞周期停滞和细胞凋亡的能力上[6，7]。
血管平滑肌细胞的凋亡与心血管疾病的发病机制密切相关，抑制血管平滑肌细胞凋亡是减缓心血管疾病尤其是动脉粥样硬化发展的有效预防策略[8]。有研究表明，p53水平与亚临床动脉粥样硬化患者的颈动脉内膜中层厚度呈正相关[9]。芳香烃受体(aromatic hydrocarbon receptor，AHR)是IS的天然配体，硫酸吲哚酚通过AHR的转运进入细胞核内[10]。笔者采用IS刺激人主动脉血管平滑肌细胞，并给与AHR的特异性抑制剂(CH223191)进行干预处理，检测p53的表达，探索IS是否能够通过AHR受体介导p53的表达。
1.细胞和试剂:人主动脉血管平滑肌细胞(CP-H081，武汉普诺赛公司)；
人主动脉血管平滑肌细胞完全培养基(CM-H081，武汉普诺赛公司)；
吲苷钾盐(I3875，美国Sigma-Aldrich公司)；
兔抗p53抗体、鼠抗GAPDH单克隆抗体(美国Proteintech公司)；
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠或兔 IgG 抗体(美国Proteintech公司)；
BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)；
高效RIPA组织/细胞裂解缓冲液(北京索莱宝公司)；
蛋白酶抑制剂(北京索莱宝公司)；
磷酸酶抑制剂(北京索莱宝公司)；
蛋白印迹法专用发光液(美国Affinity公司)；
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(北京索莱宝公司)；
实时定量 PCR 试剂盒(美国Invitrogen公司)；
RNA 提取试剂盒(美国Omega公司)；
cDNA 第一链合成试剂盒(中国MCE公司)；
SYBR Green PCR Master Mix(美国Sigma-Aldrich公司)；
Trizon Reagent、Ultrapure RNA 超纯 RNA 提取试剂盒(江苏康为试剂公司)；
反转录试剂盒(北京全式金公司)。
2.细胞培养:人主动脉血管平滑细胞用完全培养基，放置在37℃、5%CO2条件下恒温培养。贴壁生长至融合状态，用0.25%的胰蛋白酶进行消化，选择生长状态良好的细胞进行传代。当细胞贴壁融合至80%以上时，更换为无血清培养基使细胞饥饿24h。每次实验均选取4代细胞，并重复实验3次。
3.Western blot法检测相关蛋白表达:收集各组细胞，加入100μl配制的细胞裂解液，冰上裂解30min后刮取细胞及裂解液，离心后取上清，选取BCA法测定蛋白浓度。取30μg总蛋白凝胶电泳分离，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1h，加一抗p53(浓度1∶1000)或GAPDH(浓度1∶10000)，4℃下孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5min，加入相应二抗室温孵育1h，洗膜后用化学发光曝光显影，以GAPDH作为对照，分析各组细胞目的蛋白的相对表达量。
4.实时定量PCR 检测相关 mRNA 表达:每组细胞加入400μl的Trizol，待细胞充分裂解后移入1.5ml的EP管中，加入80μl的氯仿，离心后取上清，加入等体积的异丙醇离心后弃上清，接着用75%的乙醇洗涤沉淀。用无菌无酶水溶解沉淀后测定RNA的浓度和纯度。将RNA反转录合成cDNA，通过PCR扩增cDNA。反应体系包括：下游引物0.75μl，上游引物0.75μl，cDNA 2μl，ddH2O 6.4μl，SYBR Green 10μl，ROX 0.1μl，总体积20μl。各基因引物序列详见表1。
表1 各基因引物序列
1.不同浓度的IS对于p53表达的影响:Western blot法结果显示，不同浓度IS(250、500、1000μmol/L)作用于人主动脉血管平滑肌细胞48h后，p53的表达显著增多。与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。
图1 不同浓度的IS对于p53表达的影响A.p53蛋白的表达的情况(Western blot法)；
B.p53蛋白的表达的情况(柱形图)，与对照组比较，*P<0.05(n=3)
2.IS作用于人主动脉血管平滑肌细胞不同时间对于p53表达的影响:Western blot法检测结果显示，500μmol/L的IS分别以12、24、48h作用于人主动脉血管平滑肌细胞。24h时p53的表达量明显增多，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，图2)。
图2 IS作用不同时间对p53表达的影响A.p53蛋白的表达的情况(Western blot法)；
B.p53蛋白的表达的情况(柱形图),与对照组比较，*P<0.05(n=3)
3.AHR抑制剂对于p53表达的影响:Western blot法结果显示，IS(500μmol/L作用48h)组，比较于对照组p53表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)。但是在加入有机阴离子转运体(organic anion transporter，OAT)抑制剂丙磺舒(150μmol/L)和AHR抑制剂CH-223191(10μmol/L)，p53的表达量明显降低，与IS组比较差异有统计学意义(P<0.05，图3)。实时荧光定量PCR的结果显示，IS(500μmol/L作用24h)会使得p53mRNA的表达量增多，在加入OAT抑制剂丙磺舒(150μmol/L)和芳香烃受体抑制剂CH-223191(10μmol/L)后，与IS组比较p53mRNA的表达量明显下降，差异均有统计学意义。(P均<0.05，图4)。
图3 AHR抑制剂对于IS诱导p53蛋白表达的影响A.p53蛋白的表达的情况(Western blot法)；
B.p53蛋白的表达的情况(柱形图)，与对照组比较，*P<0.05;与IS组比较，#P<0.05(n=3)
图4 AHR抑制剂对于IS诱导p53mRNA表达的影响与对照组比较，*P<0.05;与IS组比较，#P<0.05(n=3)
笔者采用IS刺激人主动脉血管平滑细胞，观察p53蛋白的表达情况，加入AHR抑制剂CH223191，探讨AHR抑制剂对于IS诱导的p53的表达情况。本研究结果表明，IS会促进p53蛋白的表达，并且随着时间的延长和浓度的升高，其表达量越来越高。AhR抑制剂会拮抗IS对于p53表达的影响。
心血管疾病是慢性肾脏病患者(chronic kidney disease,CKD)死亡的重要原因。近年来研究证实，CKD诱发心血管疾病的发生与IS的蓄积密切相关[11]。IS是目前研究最广泛的尿毒症毒素，在肾衰竭时常积聚在血液中，给人体带来很大危害[12,13]。Barreto等[14]研究表明，在CKD患者中，心血管死亡风险与IS水平升高密切相关。IS可诱导CKD患者的靶器官损伤，并引起心血管疾病、肾性骨营养不良、肌肉萎缩和贫血等并发症[15,16]。IS刺激CKD中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，从而引发心血管风险，并且通过对系膜细胞的直接细胞毒性作用损害肾小球滤过，进一步加重IS的积累[17]。研究表明升高的IS诱导氧化应激、促炎反应和增强的内皮细胞中黏附分子的表达，并且IS对内皮细胞的毒性作用导致CKD患者心血管疾病的发生、发展[18]。IS通过OAT转运体进入细胞，发挥其功能。先前有研究表明，AHR是尿毒症毒素的激动剂[19]。如今已被证实IS是AHR的配体，它可通过芳香烃受体的介导转运进入细胞核内[20]。AHR是一种转录因子，通过与特定配体结合来调节广泛的生物学和毒理学效应。AHR 配体广泛存在于各种内部和外部环境中，不同的配体会表现出不同的反应[21]。据报道，AHR与CKD的整个过程都密切相关[21]。
p53是一种转录因子，通过反式激活和反式抑制参与调节多种基因以及功能，包括DNA损伤、癌基因表达、核糖体功能障碍和氧化应激[22]。p53表达的升高促进了细胞凋亡、细胞周期停滞和代谢改变[23]。因此，长期以来p53主要被认为是一个重要的肿瘤抑制因子。然而，它在其他病理过程中也发挥作用，其在各种心血管疾病中的作用受到关注[23]。越来越多的研究表明，p53在包括心肌在内的心血管疾病中发挥重要的调节作用。Annarosa等[24]研究确定在心脏功能障碍的狗模型中，p53的表达和活性增加，伴随着程序性细胞死亡增加。在病理性心血管环境中，p53在患者样本和动物模型中的表达都升高，在晚期心力衰竭患者中检测到p53表达增加[25]。升高的p53通过抑制血管生成、细胞程序性死亡、代谢调节和细胞周期停滞调节发挥调节作用。这在很大程度上促进了心血管疾病的发展，特别是心肌梗死、肥厚性心肌病、扩张型心肌病和糖尿病心肌病的心脏重构。p53在动脉粥样硬化的中的作用也被发现。动脉粥样硬化的病理过程涉及p53对动脉粥样硬化相关细胞增殖和衰老的调节。巨噬细胞是动脉硬化斑块中的重要细胞，在斑块形成过程中发挥着重要作用。p53可通过增加巨噬细胞的增殖来促进动脉粥样硬化斑块的形成[26,27]。
综上所述，IS和p53都与心血管疾病的发生密切相关。本研究通过时间依赖和剂量依赖两种方式证实了IS会促进人主动脉血管平滑肌细胞上p53的表达。在加入了AHR抑制剂CH223191之后，p53的表达又降低。这表明IS可能会通过AHR的介导转运进入细胞核内，然后促进p53的表达。
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