■张瑞刚赵靖婷蔡宇婷
（1.吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033000；
2.山西大学环境科学研究所，山西太原 033006）
黑豆是一种药食同源的豆科植物，含有黑色素物质和多种人体所需要的维生素，具有丰富的营养，长期食用可以刺激人类生殖器官的发育，防止癌症、心血管疾病和其他疾病[1-4]。但在黑豆加工制油或者精加工过程中，黑豆种皮作为副产物大多被遗弃，造成资源的巨大浪费[5]。研究发现，黑豆种皮多酚具有良好的抗氧化活性和杀菌效果，有助于其在食品包装、动物饲料等领域应用和发展[6-7]。目前，已有研究将植物多酚应用在饲料工业。汲全柱[8]研究发现，在动物饲料中添加适宜剂量的茶多酚，可改善肉品质、提高动物生产性能。Gessner等[9]研究发现，日粮中使用虫草菌粉和多酚枣粉能够提升仔猪免疫力。李伟等[10]研究发现，桉叶多酚可以改善肉色a*值，显著改善肉色。薛梅[11]研究发现，饲料中添加茶多酚能使蛋黄和血清中的胆固醇含量降低，改善鸡蛋品质。Ji 等[12]研究发现，茶多酚作为饲料添加剂能有效促进猪生长、提高免疫机能和肉品质，在繁殖性能等方面也起到积极作用。动物饲料中添加植物多酚，能改善动物生产性能，提高营养物质利用率[13]。植物多酚作为饲料添加剂，还是一类纯天然、无污染、无耐药性的抗生素替代物，是未来饲料行业中一种潜力较大的饲料添加剂[14-15]。
本研究以黑豆种皮为原料，采用超声波辅助提取法，探讨乙醇浓度、料液比、提取时间、超声功率对黑豆种皮多酚提取率的影响，优化黑豆种皮多酚的提取工艺并研究了黑豆种皮多酚的抑菌活性，以期为黑豆种皮多酚在饲料中的应用提供参考。
1.1 材料与设备
1.1.1 试验材料
新鲜黑豆，市售；
无水乙醇，购自上海国药集团；
没食子酸标准品、福林酚显色剂，购自北京奥秘佳得医药科技有限公司；
碳酸钠，购自国药集团化学试剂有限公司；
牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，购自北京北纳创联生物技术研究院。以上化学试剂均为分析纯。
1.1.2 试验设备
XZ-15DTD 型超声波清洗机、LGJ-30FD 型冷冻干燥机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司；
BSA224S 型电子分析天平，购自美国FTC 公司；
UV-1801 型分光光度计，购自北京瑞利分析仪器有限公司；
TGL-16型高速离心机，购自上海力申科学仪器有限公司；
SCRC型恒温水浴锅，购自上海仪天科学仪器有限公司；
DHG-9035 型电热鼓风干燥箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2 多酚提取工艺优化
1.2.1 黑豆预处理
将新鲜的颗粒饱满的黑豆清洗干净，加入温水浸泡24 h，将黑豆剥皮，晾干风干黑豆种皮，于50 ℃的烘箱中干燥至恒重，粉碎后过250 μm筛，将过筛后的黑豆皮粉末置于棕色的磨砂瓶中，保存备用。
1.2.2 单因素试验
1.2.2.1 乙醇浓度对多酚提取率的影响
分别设置30%、40%、50%、60%、70%的乙醇浓度，料液比1∶25（g/mL），超声机功率为500 W，超声70 min，进行多酚的提取，进行3 次平行试验，记录多酚提取率最高时的条件。
1.2.2.2 料液比对多酚提取率的影响
分别设置1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）的料液比，在50%的乙醇溶液中、超声机功率为500 W下超声70 min，进行多酚的提取，每组操作3次，记录多酚提取率最高时的条件。
1.2.2.3 提取时间对多酚提取率的影响
在1∶25（g/mL）的料液比和50%乙醇溶液中，设置超声机功率为500 W，分别设置提取时间为50、60、70、80、90 min，进行多酚的提取，每组操作3 次，记录多酚提取率最高时的条件。
1.2.2.4 超声功率对多酚提取率的影响
在1∶25（g/mL）的料液比和50%乙醇溶液中，分别设置300、400、500、600、700 W 的超声功率，超声70 min 进行多酚的提取，每组操作3 次，记录多酚提取率最高时的条件。
1.2.3 响应面试验设计
考虑乙醇浓度、超声时间、超声功率对提取率的影响，采用Design-Expert 8.0.6 软件，用Box-Bohnken Design 响应面法对黑豆种皮多酚的提取工艺进行优化，响应面试验设计见表1。
表1 响应面分析的因素水平
1.2.4 多酚提取率测定
以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu 比色法（FC法）测定多酚含量[16]。
标准曲线回归方程为Y=0.126 73X+0.027 07，R2=0.999 5，线性关系良好。样品中总酚含量以每毫升样品中没食子酸当量（mg）表示。计算黑豆种皮多酚提取率。
式中：W——黑豆种皮多酚含量（mg/g）；
C——多酚质量浓度（mg/mL）；
V——提取液体积（mL）；
w——黑豆种皮粉末质量（g）。
1.2.5 多酚纯化
将在最佳工艺条件下得到的黑豆种皮多酚，以5 000 r/min 的速度离心15 min，取上清液，旋转蒸发浓缩，以浓缩液∶无水乙醇为1∶10进行乙醇沉淀操作，过滤后在4 ℃下放置24 h，离心，冷冻干燥，所得到的粉末即为含有黑豆种皮多酚的粗提物。
1.3 黑豆种皮多酚的抑菌活性
采用滤纸圆片法[17]测定黑豆种皮多酚的抑菌活性。首先将滤纸切成直径5 mm 圆片，经高温蒸汽灭菌后干燥备用。然后配制牛肉膏蛋白胨培养基及固体平板，利用接种环将大肠杆菌及枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基中培养约20 h，制成菌体浓度为1011～1012CFU/L 的菌悬液。将黑豆种皮多酚配制成浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/mL的水溶液，分别取5 张直径5 mm 的无菌滤纸放入不同浓度的多酚溶液中浸透后，将滤纸放入含菌平板培养基中，取无菌纯化水作为空白对照组，倒置平板，37 ℃恒温培养24 h，观察测量抑菌圈直径。抑菌活性的大小直观表现在抑菌圈大小方面，抑菌圈直径越大说明黑豆种皮多酚的抑菌效果越好，反之亦然[18]。
1.4 数据处理与统计分析
所有数据统计分析采用SPSS 22.0 进行；
制图均采用Origin Pro 2021 进行；
使用Design Expert 8.0 软件进行响应面优化设计试验及方差分析。
2.1 黑豆种皮多酚提取工艺优化
2.1.1 乙醇浓度对于多酚提取率的影响
由图1 可知，当乙醇浓度从30%增加到60%时，黑豆种皮多酚提取率逐步升高；
随着乙醇浓度从60%增加到70%，多酚提取率逐渐下降。因此，乙醇浓度为60%时黑豆种皮多酚提取率最高。
图1 乙醇浓度对于多酚提取率的影响
2.1.2 料液比对多酚提取率的影响
由图2 可知，适当的料液比可提高多酚提取率。当料液比从1∶15（g/mL）减少到1∶25（g/mL）时，多酚提取率逐渐增加；
随着料液比进一步减少，黑豆种皮多酚提取率逐渐减少；
因此，料液比为1∶25（g/mL）时黑豆种皮多酚提取率最高。
图2 料液比对于多酚提取率的影响
2.1.3 提取时间对多酚提取率的影响
由图3可知，随着超声时间增加多酚提取率提高并逐渐稳定。在50～60 min内，多酚提取率迅速提高，60 min 后多酚提取率随时间变化幅度较小，逐步稳定。因此，超声时间为60 min时提取率基本达到平衡。
图3 提取时间对多酚提取率的影响
2.1.4 超声功率对于多酚提取率的影响
由图4可知，超声功率过大或过小都不会得到最佳的提取率，当超声波功率从300 W 增加到400 W时，多酚提取率逐步上升；
超声功率超过400 W后，多酚提取率逐渐下降。综合认为超声功率为400 W 时多酚提取率最高。
图4 超声功率对于多酚提取率的影响
2.2 响应面优化试验
2.2.1 Box-Behnken试验回归模型的建立及方差分析以黑豆种皮多酚提取率为评价指标的响应值，选择对多酚提取率影响较大的三个因素：超声时间（A）、乙醇浓度（B）、超声功率（C）进行Box-Behnken 试验优化，获取提取黑豆种皮多酚的最佳条件。响应面试验结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 响应面试验结果
表3 方差分析结果
用Design-Expert 8.0.6.1 软件设计响应面试验，进行拟合分析，得出多酚提取率（Y）与超声时间（A）、乙醇浓度（B）、超声功率（C）三因素变量的二次方程模型为。
Y=+ 11.13 + 0.051A+ 0.14B+ 0.11C+ 0.022AB+0.020AC-7.500E-003BC-0.71A2-1.44B2-0.84C2
根据表3 方差分析结果可知，回归模型P＜0.01，表明该试验模型极显著。失拟项P=0.613 8＞0.05，差异不显著，说明试验误差可以忽略不计，模型的预测基本可靠，可见本模型适合本研究试验。回归方程R2=0.999 3，表明三种因素对多酚提取率的影响之间的多元回归关系差异显著，试验设计基本正确。
2.2.2 响应面试验中交互项作用分析
各因素交互对黑豆种皮多酚提取率影响的响应面见图5。
从图5 可知，AB、AC、BC交互项的等高线基本上呈圆形，说明在编码值范围内，AB、AC、BC交互项的交互作用影响均不显著。
图5 各因素交互对黑豆种皮多酚提取率影响的响应面
2.2.3 验证试验
根据响应面试验，确定最佳工艺条件为：超声时间：64.21 min；
乙醇浓度：60.27%；
超声功率：403.81 W。根据实际情况，调整以上参数，取整数值分别为：超声时间65 min，乙醇浓度60%，超声功率400 W。为验证模型的可靠性，进行3 次验证试验，测得多酚提取率为（11.26±0.08）mg/g，实际数值与模型预测数值相近，表示模型准确。
2.3 多酚的抑菌活性研究
由表4 可知，黑豆种皮多酚浓度为0.050 mg/mL时，两种细菌的生长均表现出被抑制（P＜0.05），且多酚浓度越大，抑菌圈直径也越大。当多酚浓度为0.050～0.200 mg/mL时，抑制枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径显著低于大肠杆菌（P＜0.05），而多酚浓度增加到0.400 mg/mL时，两者抑菌圈直径相似，差异不显著（P＞0.05）。这表明0.050～0.200 mg/mL 的黑豆种皮多酚对大肠杆菌的抑制性强于对枯草芽孢杆菌的抑制，而当多酚浓度达到0.400 mg/mL时对二者有相同程度的抑制作用。这一结果可为黑豆种皮抑菌饲料的开发提供理论参考。
表4 黑豆种皮多酚对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果
3.1 黑豆种皮多酚提取工艺研究
多酚类化合物常用提取方法包括有机溶剂提取、快速溶剂萃取、超高压及超临界萃取、酶辅助提取等。这些方法存在着许多缺点，主要有提取过程中所耗费的时间太长、过程繁琐复杂、预处理的过程中耗材较高、提取出的多酚类化合物纯度差，有部分溶剂会残留在提取物中等。而采用超声辅助提取法进行多酚类化合物的提取具有提取效率高、损失小等优点。近年来，超声波提取技术被广泛运用于植物天然活性物质提取，Liu 等[19]采用超声微波协同法提取玉米芯中半纤维素，取得了较高提取率；
胡桂莲[20]采用超声辅助提取紫花苜蓿黄酮类物质，可以提高紫花苜蓿黄酮类物质的提取率。而超声波提取多酚受多种因素的影响，在不同条件下，多酚提取率不同，不同的有机溶剂浓度、不同的提取温度、不同的pH等都会影响多酚提取率。
在本试验中，当乙醇浓度为60%时提取率最高，这主要是由于有机溶液的极性特点，不同浓度溶剂中多酚溶解能力不同，多酚易溶于乙醇等有机溶剂，且乙醇极性随着浓度的增加不断增大，溶液的极性逐渐增大[21]。同时适当的料液比可提高多酚提取率。当料液比1∶25（g/mL）时，提取率最大，可能由于溶液体积增加，使黑豆种皮和提取物更能充分接触，多酚容易从蛋白质和多糖中分离，多酚在乙醇溶液中的溶解度增加，当料液比进一步增加时，其他杂质进入提取液，阻止多酚溶解，降低多酚提取率[22]；
另外，随着超声时间增加，提取率提高，并逐渐稳定，在50～60 min内提取率迅速提高，60 min 后提取率不随时间变化，这主要由于植物中的大多数多酚不是游离的，而是与蛋白质、多糖等结合在一起，因此，用超声波辅助乙醇打破了两者之间的结合力，故多酚提取率提高，而60 min 以后，超声波振动使溶液和溶剂完全混合，多酚基本沉淀，提取率基本没有变化。另外，研究发现超声功率为400 W时多酚提取率最高，这主要是由于超声功率如果过大，多酚的物质结构会被破坏，导致多酚提取率降低[23]。
3.2 黑豆种皮多酚的抑菌活性
随着抗生素在饲料中使用被禁止，目前关于天然植物提取物的抑菌效果研究越来越受到重视。天然植物中含有大量的抑菌物质，其中包括多酚类、黄酮类、生物碱类、多糖类、皂苷类、有机酸类等，其中抗菌活性最强的是酚类化合物。大量研究表明，酚类物质在动物饲料中有较好的抑菌效果。钟雅静等[24]研究发现，茶多酚对鸽源性大肠杆菌具有良好的抑菌效果，可以显著抑制其生长、运动和毒力基因的表达。贾睿等[25]研究发现，红豆皮多酚提取物对李斯特菌和沙门氏菌均有较好抑制效果。本次试验中，发现黑豆种皮中提取的多酚，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有抑制效果，多酚浓度大于0.050 mg/mL时，均可抑制两种菌的生长，而多酚浓度为0.050～0.200 mg/mL时，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径显著小于大肠杆菌，说明对大肠杆菌的抑制作用更强；
多酚浓度增加到0.400 mg/mL时，两者抑菌圈直径相似。在后期的研究中需更加深入研究黑豆种皮多酚的抑菌浓度，这将有利于为后续绿色饲料添加剂的开发提供理论依据。
结果表明，超声波辅助提取黑豆种皮多酚的最佳工艺为：料液比1∶25（g/mL）、超声时间65 min、乙醇浓度60%、超声功率400 W，提取率为（11.26±0.08）mg/g，与理论值相近。同时，浓度大于0.050 mg/mL的黑豆种皮多酚可以抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长，且抑制大肠杆菌作用大于枯草芽孢杆菌。
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