胡敏敏，董庆利，秦晓杰，胡丽丽，王 园，2，刘阳泰*
（1 上海理工大学健康科学与工程学院 上海 200093 2 上海中侨职业技术大学 上海 201514）
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）是一种革兰氏阳性菌，广泛分布在空气、农场、食品生产环境中，可在0℃以下繁殖，最适生长pH 值范围为4.6～9.5，可生长水分活度低至0.92[1]。单增李斯特菌主要通过受污染的食物进入人体，可导致侵袭性李斯特菌病，从而引发患者出现脑膜炎、流产，甚至死亡等严重后果，致死率高达20%～30%，是目前备受关注的一类食源性致病菌[2-3]。据报道，我国多类食品及其供应环境中均发现单增李斯特菌的污染问题，如肉及肉制品[4]、即食食品[5]、果蔬农产品[6]等，对其持续污染与生存能力的探究逐渐成为该领域研究人员关注的重点。
单增李斯特菌在食品供应链的不同环节会遭遇多种环境压力，如热、冷、酸、干燥、高渗透压、营养缺失等，耐受复杂的环境压力是其能持久污染的重要前提和原因[7]。同时，单增李斯特菌还可在逆境下形成生物膜以抵抗外界消毒剂或抗生素作用，并能产生交叉抗性[8]，导致相关风险进一步提升。明确单增李斯特菌在不同压力条件下的生态表现与调控过程，是阐明和评估其在食品及相关环境潜在危害的重要途径。在上述环境压力中，营养缺失条件常见于食品加工储运等环节的食品接触表面或不支持微生物生长的食品中，已有学者开展了部分基础性研究。然而，目前尚无文献能较为全面地总结相关条件下单增李斯特菌的表型特征及调控机制。对此，本文从单增李斯特菌的生物膜形成能力、抗性和毒性3 个方面阐述其在不同营养状态下的表型特征，并阐释σB、（p）ppGpp 和sRNA 3 类物质在单增李斯特菌营养调控过程中的重要作用。
在生态学上，胁迫（Stress）是指一种显著偏离于生物适宜生活需求的环境条件。然而，在微生物的营养胁迫相关研究中，针对其营养胁迫的定义及条件设置标准尚未统一，因此可认为微生物的营养胁迫即不能满足微生物生存需求的营养环境条件。
从营养结构的角度来看，营养胁迫可以是缺少某类或多类微生物生存所需的营养组分的条件，通常也被称为饥饿（Starvation）条件。例如，有研究将大肠杆菌悬浮在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中引发饥饿适应进而探索大肠杆菌的存活[9]，也有研究将鼠伤寒沙门氏菌悬浮在灭菌后的海水中引发饥饿进而探索鼠伤寒沙门氏菌膜脂肪酸的变化[10]。PBS 和灭菌后的海水虽不能给细胞提供充足营养，但可维持渗透压平衡（即稳定环境pH 值）并引发微生物饥饿适应。此外，部分研究还重点关注了碳氮营养组分缺失情况下微生物的生存[11-12]。饥饿条件会引发微生物饥饿生存反应（Starvation survival response，SSR）[13]。SSR 是微生物对生长和存活所需营养不足时产生的生理适应，这种生理适应表现在蛋白质和细胞壁的生物合成以及摄取死亡细胞的营养物质。需要说明的是SSR 是在葡萄糖或多种营养物的缺乏下诱导的，而不是在氨基酸的限制下[14]。SSR 提供了微生物饥饿环境下存活的机制，等到环境条件变得适宜后继续正常生长。
从营养量的角度来看，营养胁迫可以是营养组分种类齐全，而某类营养组分或多类营养组分的数量不能满足生长需要的条件，营养素通常以一种低浓度的形式存在。目前相关研究对此类营养胁迫环境多用稀释的培养基进行模拟，是一种寡营养（Oligotrophication）状态[15-17]。值得注意的是，大部分研究对所设置稀释倍数的依据缺乏详细说明，导致试验结果可能无法应用于食品风险评估中。
表1 单增李斯特菌营养胁迫相关条件设置Table 1 Condition setting related to nutrient stress of Listeria monocytogenes
此外，真实食品基质也会对微生物造成营养胁迫，食品微环境可能同时存在营养结构缺失和营养量的不足。例如，Casadei 等[21]的研究表明，黄油中基本营养物质有限和这种食物的物理结构可能会导致单增李斯特菌处于饥饿状态。未来研究可针对真实食品基质，探讨食品基质的营养结构对单增李斯特菌的生长、失活等特性产生的影响。
由此可见，营养胁迫这一概念包含的处理十分广泛，稀释的培养基、某一组分缺失的培养基、真实食品基质、接触表面食物残存、自然环境都可以纳入其中，然而每一种处理的营养胁迫程度是不同的。单增李斯特菌在生长繁殖过程中需要不断地吸收各种营养素，并将这些营养物质用于合成细胞物质以及为细胞的各种生命活动提供能量。然而，在实际的食品供应链环节中，环境不能总是给予单增李斯特菌的充足的营养，单增李斯特菌在接触面上的营养来源可能依赖于食物残留，真实食品基质中的单增李斯特菌依赖于食品成分，上述情况都不是最适宜单增李斯特菌生长的养分条件，迫使单增李斯特菌处于营养胁迫中。
营养胁迫下的单增李斯特菌与纯培养状态的单增李斯特菌会有生理表型和菌体状态的差异。单增李斯特菌能够在完全营养缺乏的情况下存活4 周，饥饿细胞可能会进入活的不可培养状态（Viable but nonculturable，VBNC）。本部分将从营养胁迫对生物膜形成能力、抗性和毒性3 方面的影响，说明单增李斯特菌在营养胁迫条件下的表型特征。
2.1 生物膜形成能力
在食品加工环境中，细菌通常黏附在表面并形成生物膜，保护自己免受外部不利影响，从而造成了其在环境中的持久污染[22-24]。单增李斯特菌通常以生物膜态从食品工厂中分离出来[25]，可见食品链环境与单增李斯特菌生物膜的形成密切相关。其中，营养胁迫可能是促进其生物膜形成重要原因之一[22]。Kadam 等[26]研究了单增李斯特菌在脑心浸出液（BHI）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、营养肉汤（NB）、基础培养基（HTM）中生物膜形成情况，指出生物膜在营养缺乏的培养基中比在营养丰富的培养基中形成能力强，寡营养条件促进了单增李斯特菌生物膜的形成。然而，Choi 等[27]的研究发现单增李斯特菌在TSB 形成的生物膜水平高于十倍稀释的TSB，这可能是由于菌株特性的差异，较大的稀释倍数导致形成生物膜的营养素过于匮乏从而形成较低水平的生物膜。目前，到底多少程度的营养胁迫条件促进生物膜的形成还没有定论。Cherifi 等[20]研究了动态条件下不同营养状态培养基中生物膜的生物量和结构情况，发现在富营养培养基（BHI）和寡营养培养基（1/10 BHI）中生长的生物膜在结构和生物量上显著差异。BHI中，生物膜结构为多层排列而成；
1/10 BHI 中，生物膜呈网状结构，膜中细胞呈长链状，且1/10 BHI的生物膜中生物量明显高于BHI，同时研究还表明有限的营养物质通过促进细胞死亡和释放细胞外DNA 对稳定单增李斯特菌生物膜结构稳定性起重要作用。营养胁迫环境下，生物膜采用链状排列形态而不是多层排列形态，增加比表面积，增强细胞吸收营养的能力。Liu 等[28]的研究表明PBS 稀释的猪肉汁促进了单增李斯特菌生物膜的形成。
需要说明的是，上述标准培养基和猪肉汁营养成分仍较为复杂，虽然尚不能确定是糖类、脂肪、脂肪酸还是矿物质对单增李斯特菌生物膜的形成产生了促进作用，但仍可认为在该营养胁迫条件下，生物膜的形成延长了单增李斯特菌种群的存活时间。同时，单增李斯特菌在食品接触表面形成生物膜后，难以通过一般清洗方法进行彻底，对于清洗较为困难的设备，如切片机和制冷机等，更是为单增李斯特菌提供了庇护，成为交叉污染的潜在源头和媒介，进而导致了食用风险上升。
2.2 抗性
食品加工过程中单增李斯特菌很少面临单一压力，通常是多种压力的共同作用，单增李斯特菌采取不同的生存机制应对不同的压力，在这些机制中又有交叉的部分。例如，单增李斯特菌面临冷胁迫时冷休克蛋白表达上调，然而渗透胁迫中也会激发冷休克蛋白的表达。冷休克蛋白影响单增李斯特菌的脱水耐受性、生物膜形成和运动性，这说明不同的机制之间会相互作用存在交叉保护。有研究表明在食物基质中生长的单增李斯特菌对60 ℃处理条件的抗性是生长在TSB 肉汤中相同菌株的4 倍[7]。Lungu 等[29]研究发现处于营养胁迫中的单增李斯特菌抵抗食品加工过程中卫生措施的能力会增强，与野生型菌株相比，sigB基因缺失（△-sigB）菌株在PBS 中抵抗丙酸钠和乳酸钠的能力高于野生型菌株，激发了SSR 单增李斯特菌对化学胁迫的较高抗性。Lou 等[30]研究了适应环境胁迫后单增李斯特菌的热抗性，发现营养胁迫后的细胞热抗性增强，饥饿后存活下来的细胞耐热性比未经饥饿处理的细胞显著提高，且饥饿时间越长，耐热性增加越大。饥饿状态下单增李斯特菌在56 ℃条件下的D值高达13.6 min。有学者研究表明饥饿8 d 后的单增李斯特菌对辐射的抵抗力增强[31]。Li 等[18]研究了啤酒花β 酸对火腿提取物中非应激和应激适应单增李斯特菌的抑制情况，将无应激、酸应激、冷应激和饥饿应激后的单增李斯特菌接种至火腿提取物中，定期监测储存期间（7.2 ℃，26 d）细菌的存活和生长，与非应激细胞相比，饥饿应激后的细胞在添加啤酒花β 酸的火腿提取物中生长速率更快、迟滞期更短，说明饥饿应激后的单增李斯特菌对啤酒花β 酸这种防腐剂的抗性增强。以上研究均表明营养胁迫条件可能诱发单增李斯特菌交叉抗性的产生。
2.3 毒性
单增李斯特菌的致病机理与几个毒力因子的表达有关。其中包括InlA 蛋白和LLO 溶菌素，InlA 蛋白由inlA编码，负责黏附和入侵宿主肠道细胞，LLO 溶菌素由hly编码，与单增李斯特菌从真核细胞的内化液泡中逃逸有关[32]。除此之外还有prfA、plcA、plcB、hly、act A、mpl、inl A、inl B、inl C、inl C2、inl D、inl E、inl F、inl G、inl H等毒力因子。Araujo 等[33]初步研究了营养胁迫下单增李斯特菌的毒力变化，发现营养胁迫下毒力是降低的。值得注意的是，此研究在低温下进行，低温下细胞活性降低，营养摄入减缓，因此可能是低温导致了营养胁迫下的单增李斯特菌较好的存活。营养应激可能对降低细菌的毒力具有作用。然而，目前对营养胁迫下毒力的关注较少，有必要研究营养胁迫应激下毒力的变化。
细菌适应营养胁迫环境既取决于营养丰富时细胞生长的速度，也取决于逆境时细胞的存活情况[34]。逆境时细胞存活情况取决于该胁迫下采用的调控机制，基因表达是调控机制的关键，而后续的调控通路因胁迫条件的不同而有所区别。本部分总结了营养胁迫下不同物质介导的调控，分别是σB介导的调控、（p）ppGpp 调控和sRNA 介导的调控，旨在深入了解营养胁迫下的单增李斯特菌可能采取的应答调控机制。
3.1 σB 介导的调控
σ 因子是原核生物RNA 聚合酶的亚单位，参与识别启动子特定的DNA 序列。单增李斯特菌包含5 个σ 因子，分别是σA、σB、σC、σH、σL，目前研究较多的是由sigB编码而成的σB。σB与单增李斯特菌的应激反应和毒性密切相关[35]。σB参与较为广泛的应激反应，包括酸应激、渗透应激、热应激以及营养应激，引发一般压力反应（General stress response，GSR），促进单增李斯特菌在压力环境下的适应。σB会导致大约300 个基因在单增李斯特菌的表达中上调[36]。此外，σB依赖基因还参与能量代谢、碳和核苷酸代谢、转录调节等过程。σB参与碳源代谢，尤其是1，2-丙二醇，1，2-丙二醇是致病菌感染宿主期间重要碳源之一[37]。由于σB可以应对广泛的压力环境，进而引发单增李斯特菌的交叉保护[38]。
营养条件会影响sigB的激活情况。有学者研究了不同碳源下（葡萄糖、甘油、乳糖）sigB的激活情况，单增李斯特菌的sigB在添加乳糖的营养肉汤中显示较高的表达水平，且其中的细胞对热胁迫和酸胁迫具有较高的抗性和较高的生物膜形成量[39]。Marinho 等[40]研究了单增李斯特菌在营养缺乏的土壤中存活情况，发现sigB缺失株与野生型的生长无明显差异，sigB和AgrA同时缺失株与野生型有显著差异，这表明sigB和AgrA对单增李斯特菌在土壤中的存活有协同作用。AgrC/AgrA双组分系统感知环境胁迫压力，AgrA调节氨基酸运输和代谢的基因、运动和趋化性的基因，Agr调控子和σB因子相互联系进而影响非生物胁迫条件下的单增李斯特菌[41]。Ferreira 等[42]研究了△-sigB菌株和10403S野生型菌株在营养胁迫下的生存能力，发现在营养胁迫下△-sigB菌株更易丧失生存能力，表明σB在单增李斯特菌营养胁迫期间的存活能力方面发挥了作用。
3.2 （p）ppGpp 介导的调控
四磷酸鸟苷（ppGpp）和五磷酸鸟苷（pppGpp），统称为（p）ppGpp 类物质。（p）ppGpp 作为信号分子可促进细菌的适应和应激能力，通常又其介导的反应称为严谨反应（Stringent response，SR）。参与（p）ppGpp 代谢的酶主要是有两种：即只具有合成功能的单功能酶RelA 和既具有合成功能又具有分解功能的双功能酶SpoT[43]。值得注意的是，单增李斯特菌的CbpB控制着（p）ppGpp 和c-di-AMP 的平衡[44]。（p）ppGpp 调节多个生理方面，如细菌的毒性、生物膜形成和群体感应，RelA 感知氨基酸饿，SpoT 感知其它环境应激源，如碳、铁、磷酸、脂肪酸饥饿[45]。（p）ppGpp 感知营养胁迫特别是氨基酸饥饿的情况，控制基因的表达程度，控制生长，当压力改变后，又能恢复原本的生长潜力[46]。此外，在营养胁迫的条件下，（p）ppGpp 通过调节转录、翻译水平和细胞周期，改变细胞的新陈代谢和生理状态，增强细菌的耐药性[47]，高浓度的（p）ppGpp 虽会增加抗生素耐药性，但是其引起耐药性机制尚不清楚，可能是（p）ppGpp 抑制磷脂的生物合成。（p）ppGpp 生成过程中GTP 的急剧下降和ATP 的增加影响了CodY的活性，CodY是一种广泛存在于厚壁菌门的营养感应转录调节因子，（p）ppGpp 和CodY 之间存在反比关系[48]。然而，目前在营养胁迫下（p）ppGpp介导的调控通路仍有待明确。
在致病菌中，（p）ppGpp 含量随细胞状态变化而变化，而其含量的高低直接影响细菌的环境适应性。例如，含有较高（p）ppGpp 水平的大肠杆菌对环境胁迫的抵抗力更强，因为（p）ppGpp 刺激了RpoS或其胁迫应答基因的表达[49]。（p）ppGpp 含量的差异可能导致了菌株特性的差异。（p）ppGpp 在单增李斯特菌中（p）ppGpp 影响生物膜的形成，△-RelA菌株不能在氨基酸饥饿时积累（p）ppGpp，而野生型菌株在胁迫诱导30 min 内积累（p_ppGpp；
且△-RelA菌株生长能力、黏附能力以及毒力都低于野生株[50]。（p）ppGpp 促进单增李斯特菌在低温下适应的作用是与氨基酸饥饿相联系的[51]，低温下细胞膜结构和组成发生变化，导致对氨基酸或其它营养物质吸收减少，诱导严谨反应。
（p）ppGpp 作用机制的研究主要集中在大肠杆菌和猪链球菌中，单增李斯特菌研究相对较少。然而，（p）ppGpp 在调控单增李斯特菌代谢方面有着不可忽视的作用，进而影响单增李斯特菌的环境适应能力和致病能力。
3.3 sRNA 介导的调控
图1 营养胁迫下单增李斯特菌（p）ppGpp 的生成和主要作用Fig.1 Production and main role of（p）ppGpp in Listeria monocytogenes under nutrient stress
小的非编码RNA（sRNAs）是具有50～200 个碱基对的短链核糖核酸，sRNAs 可能通过多种机制起作用，大多数已被证明在转录后水平通过与靶基因的碱基配对起作用，对翻译或基因稳定性有积极或消极的影响，从而调节多种生理活动[52]。为了应对营养相关的应激环境，细菌通过调节吸收营养物质对环境产生适应，近年来研究发现sRNAs 对细菌的生长繁殖、生物膜形成、应激耐受、营养代谢吸收起着重要作用[53]。新月柄杆菌能营养贫瘠的环境中生存，当经历碳饥饿后，新月柄杆菌大量合成sRNA-CrfA，并诱导了27 个基因表达上调，这些靶基因中有三分之一编码TonB依赖性受体，表明sRNA-CrfA与新月柄杆菌碳源胁迫调控相关，sRNA-CrfA能激活碳源吸收相关基因的表达[54]。Jonas 等[55]表明sRNA-CsrB和sRNACsrC的水平是响应培养基中营养可用性的结果，在营养不足的基本培养基中，sRNA-CsrB和sRNA-CsrC水平较高，而在复合LB 培养基中，sRNA-CsrB和sRNA-CsrB表达较低。
迄今为止，单增李斯特菌被鉴定出的sRNA已有200 多种。单增李斯特菌暴露于压力环境时，会产生数百个sRNA[3]。sRNA-gcvB可抑制寡肽转运蛋白（Opp）和二肽转移蛋白（Dpp）的生成[56]，推测在氨基酸缺乏的培养基gcvB的表达或许受到抑制，以促进胞外氮源向细胞内转移。最近有研究[57]利用计算机和试验相结合的方法揭示了sRNA-Rli47在单增李斯特菌营养应激中的生理作用。sRNA-Rli47与ilvA-mRNA 核糖体结合位点结合，抑制异亮氨酸的生成中，在氨基酸缺失的培养基中，△-Rli47观察到了更短的滞后期，说明sRNA-Rli47在单增李斯特菌氨基酸代谢方面起作用，进一步抑制生长、促进存活。sRNA-LhrC控制靶基因lmo 2349的表达，lmo 2349编码氨基酸ABC 转运蛋白的底物结合蛋白和寡肽结合蛋白的oppA，影响毒力[58]。研究调查了单增李斯特菌sRNA-LhrC和sRNA-LisRK对土壤环境中生长和存活的作用，与野生型菌株相比，缺乏lisR、lisK或LhrC在无菌和非无菌土壤中应对恶劣条件的能力较低，同时单增李斯特菌存在于无菌土壤中时sRNA-LisRK和sRNA-LhrC影响基因表达[3]。
目前关于单增李斯特菌sRNAs 应对营养胁迫的功能主要集中在营养不充分的土壤中，未来的研究应该集中在探索单增李斯特菌在食品生产和食品储存过程中sRNAs 功能分析，以充分理解sRNA 介导的调控对单增李斯特菌引发食品暴发事件。
3.4 其它可能的调控
eut、pdu和cob/cbi操纵子参与乙醇胺（EA）和丙二醇（PD）的代谢，三者组成一个大的基因座，统称为钴胺素依赖基因簇（CDGC），CDGC 在单增李斯特菌中是保守的，一些研究表明当单增李斯特菌暴露于食品及食品加工环境相关的压力时CDGC 会发挥作用，然而CDGC 在应激方面的功能表征远远少于毒力方面。Tang 等[59]发现，与富培养基中生长相比，低温真空包装鲑鱼上生长的单增李斯特菌CDGC 表达增强。σ 因子，双组分调节系统，sRNA 如sRNA-Rli39参与调节CDGC，上述中说明σ 因子和sRNA 参与营养胁迫下的调控，然而CDGC 调节网络复杂，更详细的调节功能及过程需要更深入的研究[60]。
营养胁迫是重要压力因子，然而目前单增李斯特菌的环境胁迫方面中营养胁迫关注较少。营养胁迫影响致病菌的定殖、存活、生长、抗性等，进而影响了致病菌的环境适应性和毒力，且营养胁迫存在于食品供应链的各个环节。目前单增李斯特菌在营养胁迫期间的调控机制的研究多集中于单基因的研究，第二信使（p）ppGpp 的研究相对较少。研究营养胁迫下单增李斯特菌的生理表型和调控机制对食源性疾病的防控具有重要意义，未来研究可从以下3 个方面展开：
1）营养胁迫下的表型研究 首先是营养胁迫下单增李斯特菌采取了怎样的应激表型去适应环境；
其次是考虑到真实食品加工很少存在只有一种胁迫的场景，进一步研究多种胁迫因素下单增李斯特菌的应答反应，有助于建立更为有效的防控措施。例如，冰箱冷藏环境同时存在冷胁迫和营养胁迫，双重胁迫下单增李斯特菌是否具有更强的环境耐受能力；
2）营养胁迫下的调控机制研究 目前已报导的几种调控因子在单增李斯特菌应对营养胁迫中发挥着重要作用，但具体作用靶标还不完全明确，后续可结合组学、凝胶迁移、DNA 足迹等技术挖掘调控因子作用的靶标，有助于了解单增李斯特菌在营养胁迫下的生存机制，为单增李斯特菌的精准防控提供关键基因；
3）营养胁迫下的交叉保护研究 交叉保护对致病菌的抗性和致病性有着不可忽视的作用，营养胁迫下会诱发交叉保护，交叉保护响应了不同的压力下的应答机制，应弄清楚这些机制之间的相互作用关系。
猜你喜欢单增李斯特生物膜冰箱囤货要警惕这个“捣蛋分子”生命与灾害(2022年8期)2022-11-10冰箱里的“杀手”党员文摘(2022年1期)2022-04-03幽门螺杆菌生物膜的研究进展现代临床医学(2021年5期)2021-11-02生物膜胞外聚合物研究进展昆明医科大学学报(2021年4期)2021-07-23基于PasteurMLST网站分析中国单增李斯特菌克隆复合体的多样性上海农业学报(2017年4期)2017-04-10光动力对细菌生物膜的作用研究进展中华皮肤科杂志(2014年4期)2014-12-19NY3菌固定化及生物膜处理含油废水的研究西安建筑科技大学学报（自然科学版）(2014年4期)2014-11-12保持肃静小小说月刊(2013年6期)2013-05-14三重LAMP法检测食品中沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌食品科学(2013年24期)2013-03-11爱之梦琴童(2009年2期)2009-02-26