徐晨晨 祝宝华 杨志艳 惠婷婷 李 燕 李晓晖,2,3
(1. 上海海洋大学食品学院，上海 201306；
2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；
3. 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海 201306)
抗氧化肽是由2～20个氨基酸残基组成的特殊蛋白片段，这些片段不仅具有营养功能，还具有抗氧化作用，可以改善机体健康。研究[1-2]表明，抗氧化肽能够通过缓解由脂质过氧化和人体过量自由基引起的氧化应激从而起到抗氧化的作用。因此，抗氧化肽成为了功能食品开发的研究热点。
酶解法和微生物发酵法是常用于生产抗氧化肽的技术[3]。但是，这两种方法反应时间长，生产效率低，限制了高活性抗氧化肽的产生。为了促进蛋白质酶解进程及提高酶解产物的抗氧化性能，一些新型加工技术应运而生。文章拟综述微波、欧姆加热、亚临界水、超声波、高静压以及脉冲电场等新型加工技术制备抗氧化肽的作用机理和应用条件，分析辅助改进酶水解效果的作用，并对比讨论生产抗氧化肽所采用的各项技术的优势和挑战。
传统的抗氧化肽制备方法有酶解法、微生物发酵法和化学合成法。酶解法，即通过特定的蛋白酶对蛋白质进行酶解，再对酶解产物中具有抗氧化活性的组分进行分离纯化。齐兴宇等[4]用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解卵白蛋白，在最优酶解工艺下得到的卵白蛋白肽具有良好的抗氧化活性，总抗氧化能力值为(9.51±0.03) U/mL。微生物发酵法是通过微生物代谢过程中产生的复合酶系，将底物蛋白酶解进而释放出具有活性肽类物质的方法[5]。发酵过程中，蛋白质来源、菌种选择、发酵温度和时间、pH等条件都会影响酶解程度[6]。宫田娇等[7]利用青春双歧杆菌与嗜热链球菌发酵柞蚕蛹蛋白，得到的发酵液具有较高的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率高达93.78%。与酶解法相比，微生物发酵法生产生物活性肽所需成本低，但该法生产周期较长、产物复杂，且生成的肽缺乏特异性，不利于高纯度抗氧化肽的制备，因而阻碍了抗氧化肽工业化生产[8]。化学合成法指以氨基酸或小肽为原料，用固相液相合成法定向合成多肽[9]。宋雪梅[10]以8条已知序列的玉米源肽为原料通过固相合成为试验原料，测定DPPH自由基清除力、ABTS自由基清除力、金属螯合力、氧自由基吸收力，结果表明，8条玉米源肽均有一定的抗氧化活性。化学合成法操作简单、快速，但合成过程中使用的部分溶剂如N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷等具有较大的毒性，此外，在极端温度、pH和压力条件下会导致氨基酸损伤。因此，化学合成法不是生产生物活性肽的首选方法。抗氧化肽的通用制备流程如图1所示。
图1 抗氧化肽的通用制备流程Figure 1 The general process for preparing antioxidant peptides
酶解法通常是制备抗氧化肽的首选方法，但该法不适于工业化生产。微波、欧姆加热、亚临界水和非热中超声波、高静压、脉冲电场等新型加工技术不仅减少生产时间和成本，还可提高多肽的得率和生物活性。
2.1 热技术
2.1.1 微波加热技术 微波通过分子间和分子内摩擦以及带电离子的运动和碰撞使细胞壁与细胞膜破裂[11]。在微波场影响下蛋白质结构变得松散，蛋白溶解度增加。此外，在微波加热条件下，底物直接吸收微波能量可能导致参与酶促反应的底物官能团具有更高的反应活性。研究发现微波加热技术处理可促进蛋白质的水解，从而产生具有较强抗氧化活性的低分子量多肽。Li等[12]发现微波辅助酶解(250 W)胶原蛋白得到的水解产物中分子量≤1 kDa 的胶原肽含量和羟自由基清除率均较非微波辅助处理组的显著增加。Chen等[13]以牛血清白蛋白和银杏蛋白为研究对象，建立了连续微波辅助酶解的方法，为生物活性肽的大规模制备提供了可能。Huang等[14]研究表明与水浴酶解相比，连续微波辅助酶解显著缩短了蓝点马鲛蛋白酶解产物的制备时间，且从所得酶解产物中分离、鉴定得到的8个潜在抗氧化肽序列的分子量为502.32～1 080.55 Da，所含氨基酸残基数量为4～10个，具有抗氧化肽的典型特征。Ketnawa等[15]研究表明鱼骨蛋白经微波90 ℃预处理5 min后进行水浴酶解，所得酶解产物的水解度、ABTS自由基清除率和还原力最高，但是相同条件微波预处理后，再进行55 ℃微波辅助酶解，水解度反而下降，推测可能原因是经过两次微波处理后蛋白质发生聚集或者重排，导致酶解程度降低。
微波加热技术能够增加酶切位点，改善水解物的理化特性，从而产生具有良好生物活性的水解产物。与传统的酶解方法相比，微波加热技术能提高酶解效率、缩短酶解时间。同时，该技术因处理过程简单、操作方便且成本低而成为潜在的工业技术。
2.1.2 欧姆加热技术 欧姆加热(Ohmic heating)也称为电阻加热或焦耳加热，是一种将交流电直接应用于半导电介质的热加工方法。欧姆加热装置如图2所示。其工作原理为将样品放入样品槽内，通入220 V电流后电能转换为热能，使食物中能量直接耗散，加热速度快且耗散均匀[16]。在传统的加热技术中，原料内部的传热取决于温度梯度，而欧姆加热无需设置原料的温度梯度就可以在较短时间内达到设定的处理温度，从而最大限度地减少异味化合物的产生，避免食品因过度热损害而失去感官和营养特性[17]。
1. 加热槽 2. 样品槽 3. 最大刻度线 4. 电极 5. 测温器 6. 温度观测器 7. 电压监测器 8. 变频器
Costa等[18]发现在2 V/cm的低电场强度下，利用欧姆加热乳清蛋白溶液至72～75 ℃，维持15 s，样品的DPPH抗氧化能力和ACE抑制活性比相同时间巴氏加热分别提高3.0%和5.5%，这是由于在欧姆加热过程中产生了生物活性肽。Jesus等[19]比较了欧姆加热和常规加热对提取生物活性化合物中抗氧化活性的影响，结果表明在中电场强度(840.0 V/cm)下欧姆加热后所得提取物比常规加热的具有更好的抗氧化活性，可能是由于冲击波引起的微观损伤导致提取物的结构变化，促进了空化气泡对组织的损伤。Coelho等[20]研究了欧姆加热和常规加热对体外胃肠消化后的番茄粉中生物活性化合物的生物可及性和抗氧化能力的影响，结果表明经欧姆加热处理后胃肠消化产物比常规处理后的抗氧化活性更高，主要是由于欧姆加热的热过程使样品中的小分子被分解成更小的分子，这些分子之间发生了化学反应，并产生了新的化合物(如生物活性肽、番茄红素)。
与传统加热方式相比，欧姆加热更适用于高蛋白食品原料加工、植物中化合物提取以及固液混合食品的高温瞬时加热，该法能最大限度地保持食品的鲜度和风味，为食品加工行业提供高质量、高附加值、耐储存的产品。但目前仍存在亟待解决的问题：一方面，这项技术限制了加工食品的种类，因为它更适用于液体和含固体颗粒的液体，同时，电导率的快速增加会导致温度升高，这可能会使样品过热；
另一方面，一个工业规模的欧姆加热系统的成本非常高，因此，如何克服系统问题及降低设备成本还需深入研究。
2.1.3 亚临界水技术 亚临界水(Subcritical water，SCW)技术是指将水加热至沸点以上，临界点以下(100～374 ℃)，并控制系统压力使水保持为液态[21]。常温常压下水的极性较强，但在亚临界条件下，随着温度的升高，水中氢键断裂，极性减弱因而对中性或非极性有机物的溶解能力增加[22]。SCW具备萃取剂和催化剂的双重功能，并且萃取过程无毒高效、环境友好[23]，因此SCW技术已被广泛应用于抗氧化肽的制备中。表1总结了亚临界水在抗氧化肽制备中的应用。
表1 亚临界水在抗氧化肽制备中的应用
SCW水解蛋白不需要酶或其他溶剂，因为在亚临界条件下，SCW的溶解能力、扩散性和自电离能力均增加，极性、黏度和表面张力均降低，导致蛋白中二硫键易断裂，从而使蛋白质裂解。因此，该技术反应时间短且安全[28]。另外，亚临界水处理后的蛋白水解物的抗氧化性取决于水解温度和压力，在一定温度和压力下蛋白质展开并被分解成多肽和游离氨基酸。Ahmed等[24]研究发现在250 ℃、5 MPa的SCW处理条件下金枪鱼皮胶原蛋白水解物水解度(DH)最高，280 ℃、8 MPa的SCW处理条件下，水解物的抗氧化性最高。SCW也可用于原料预处理，通过酶催化增强水解物的抗氧化活性。lvarez等[27]使用SCW处理猪血红蛋白，结果表明当处理时间达360 min时获得的产物显示出良好的抗氧化活性，平均分子量在2.1 kDa的肽占比达83%。SCW预处理(200 ℃、37.5 MPa)对胰蛋白酶催化效率远高于传统加热预处理的，因此，SCW处理后的酶催化有潜力成为一种先进的水解技术[29]。然而，该技术需用到高压设备和大量的能源因而成本非常高，需要精细的工程试验和设计来优化亚临界水工艺，进而降低资金和运行成本[30]。
2.2 非热技术
2.2.1 超声处理技术 超声波(Ultrasonic wave)是一种新型的非热物理技术，频率介于20 kHz～1 GHz，依赖于机械波在介质中传播。超声处理因无污染，操作简单和易控制等优点被广泛应用于食品加工中。超声处理在反应体系中可产生热、空化及机械效应等，在提高传质能力的同时促进底物进入酶的催化部位，使底物与酶的接触机会增加，提高酶解速率，缩短酶解时间，获得含量丰富的活性多肽[31-32]。
超声处理技术可水解一些食物蛋白以产生抗氧化肽，例如猪肝蛋白[33]、β-乳球蛋白[34]、刺桐籽蛋白[35]和玉米蛋白[36]等，如表2所示。超声处理技术主要用于预处理，即通过超声改变蛋白质结构，使更多酶水解位点暴露，增加原料DH，提高水解物的抗氧化活性。Liang等[36]研究发现优化后的超声酶解技术可以制备玉米蛋白抗氧化肽，在最佳超声处理(65 W/L；
开/关时间2 s/2 s)条件下，玉米蛋白酶解液羟自由基、DPPH自由基清除率显著提高，质谱分析发现超声预处理后含有疏水性氨基酸的肽形成。同样，Wang等[37]研究表明β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白经超声波水解后，蛋白水解产物的DH、游离巯基和金属螯合力显著提高。这可能是由于超声处理后两种蛋白中α-螺旋和β-转角比例增加，β-折叠和无规则卷曲比例减少。
表2 超声处理技术在抗氧化肽制备中的应用
超声具有能量传递快，温度低和加工成本较低的优点。通过超声处理可以增加产率，使提取过程响应更快[38]。与低压溶剂萃取方法相比，超声提取时间预计缩小到原来的1/10。因此，超声可解决传统酶解蛋白质转化率低，水解时间长等问题。
2.2.2 高静压技术 高静压(High hydrostatic pressure，HHP)技术通常采用100 MPa以上(100～1 000 MPa)的压力对物料进行处理[39]。研究[40-41]表明，这种技术可以改善食品的货架期，同时对食品的营养价值和感官品质影响小。与影响共价和非共价键的热处理技术不同的是，HHP技术破坏相对较弱的化学键如氢键、疏水键和离子键，而非共价键。该技术主要影响蛋白质二级结构，不影响蛋白质的一级结构，HHP对结构改变是否可逆取决于加压参数和蛋白质的性质[42]。
HHP通过改变食品中蛋白质构象、促进蛋白质分子链延伸来增加酶切位点，还可以影响蛋白酶的结构，对酶催化活性产生影响。Franck等[43]通过HHP处理可显著提高亚麻籽蛋白的DH，小分子肽的生成量随着压力和处理时间增大而增加，肽含量增加与抗氧化活性的提高直接相关，另外，该研究也证明了通过同时加压和酶解提高生物活性肽产量是可行的。Guan等[44]考察了不同HHP水平(80～300 MPa)下酶催化，大豆分离蛋白经200 MPa处理4 h后得到的水解产物具有较高的还原力、ABTS自由基清除率和ACE抑制活性。Dong等[45]研究发现在300 MPa、 60 min和100 MPa、180 min处理条件下，花生蛋白水解产物的DH、还原力和DPPH自由基清除率明显提高。
与传统方法相比，HHP技术具有多项优势，它可以在环境温度下进行恒定均匀的加压，减少处理时间。但昂贵的基础设施成本以及批量操作限制了该技术在食品领域的应用。HHP设备初始投资相关成本为60万～400万美元，占总投资的75%～80%，与HHP相关的加工成本为小型设备的0.14欧元/kg到大型设备的0.071欧元/kg不等[46]。
2.2.3 脉冲电场技术 脉冲电场(Pulsed electric field，PEF)具有较高的电场强度(10～50 kV/cm)、较短的脉冲宽度(0～100 μs)和较高的脉冲频率(0～2 000 Hz)等特点[47-48]。PEF主要通过对蛋白分子的极化和打破分子的内部共价键等作用力来影响蛋白质结构。PEF在抗氧化肽的制备中的应用如表3所示。
表3 脉冲电场技术在抗氧化肽制备中的应用
PEF技术具有成本低廉、效率高等特点，并且在生产线中引入脉冲电场处理单元较容易。然而，不同介电性质的食品组分会对不均一的产品性状产生不同的影响，所以相较于简单的悬浮体系，脉冲电场应用于复杂的食品体系中具有一定的挑战[53]。因此，有必要重新设计或改善现有的PEF系统处理室，以适应不同类型的食品加工。大功率电源是PEF设备发展的重点，以保证高强度电场，从而适应大规模工业化生产。此外，对于商业规模的扩大，PEF可与其他处理技术相结合，通过协同作用提高食品功能性，将该技术成功地应用于食品工业。
近年来，许多学者对不同技术协同作用进行了应用研究，尤其是结合热处理和非热处理在应用中最为广泛。康永锋等[54]在超声波—微波辅助酶解鲑鱼过程中发现，碱性蛋白酶酶解得到的鲑鱼肽的超氧阴离子自由基清除率高于仅采用超声波或微波辅助酶解的，说明一定条件的超声波与微波辅助酶解在抗氧化肽制备中具有协同效应。Hanbinshuti等[55]采用超声波—微波辅助酶解制备的甘薯蛋白抗氧化肽中，3 kDa以下组分肽段具有潜在的抗氧化活性，与未处理的样品相比，超声波—微波辅助酶解显著提高了甘薯蛋白水解物的DH。Alizadeh等[56]将乳清浓缩蛋白(WPC)经过欧姆加热和超声波以及它们的组合预处理后，发现组合预处理显著提高了WPC水解产物的DH，且其羟自由基、DPPH自由基清除率和还原力等抗氧化活性均高于单独欧姆加热和超声波的。
热技术和非热技术在其他天然抗氧化剂提取中的应用也是目前研究的热点。如陆海勤等[57]通过优化超声协同脉冲电场提取黄花菜多糖的工艺，在提取时间30 min，提取温度59 ℃，超声功率700 W，电场电压14 kV下，得到的黄花菜多糖得率为10.03%，同时体外抗氧化活性结果表明，当黄花菜粗多糖质量浓度为1.0 mg/mL时对超氧阴离子自由基、羟自由基以及DPPH自由基的清除率分别可达到66.93%，70.61%，49.28%。
在实际应用过程中，研究机构和学者利用相关的技术对相关设备进行了改进，提高了设备的性能。胡双飞等[58]对亚临界水提取设备中的提取釜结构进行改进，增加了原料与亚临界水的接触面积，结果发现螺旋藻粗蛋白的ABTS自由基、DPPH自由基、羟自由基清除率在质量浓度0.15～10 mg/mL范围内均具有较强的抗氧化活性。超声设备通常采用单频超声，Wang[59]发明了双频聚能式超声设备，研究了单频、双频和三频超声及其组合对不同食品蛋白结构的影响。张鸣镝等[51]发明了脉冲电场处理装置，利用该设备可显著提高红松籽抗氧化肽活性。这些设备的改进有助于提高了抗氧化肽的活性制备效率，改善其功能特性。
微波、超声、高静压等新型加工技术可改变蛋白质的结构特性，缩短酶解时间，可在一定程度上提高抗氧化肽的功能特性。同时，不同新型加工技术的协同作用在抗氧化肽制备研究中也显现出巨大的应用潜力，它可在一定程度上改善抗氧化肽的功能特性，为今后的研究提供一种创新设计。
虽然一些方法在实验室中制备抗氧化肽是可行的，但若要进行工业化应用，还要考虑到生产成本和操作工序。此外，一些加工技术虽然效果比较好，但也存在各种问题，如欧姆加热和脉冲电场限制了加工食品的种类，高静压、亚临界水技术的可行性和安全性问题。因此，在考虑生产成本、食品种类和安全性问题时，采用微波和超声是制备抗氧化肽较好的新型加工技术。今后对新型加工技术制备产物的结构和组成应进行更加深入的分析，在加工过程中产物的安全性也是研究的重点。同时借助新型加工技术辅助提高酶解底物浓度，提高制备抗氧化肽的含量，高效精准进行酶解特定产物的工艺条件和分离相关设备等也需进一步研究。
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