陆赛健，张洵浩，周迎蕾，王歆竹，胡 珀，郭 亮，陈 景，杨光明，钟 蕾，潘 扬
（南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023）
巴豆为大戟科植物巴豆（Croton tigliumL.）的干燥成熟果实，又称刚子、巴菽或者双眼龙等。其性热，味辛，内服用于治疗寒结便秘、腹水肿胀等，外用可以治疗恶疮疥癣［1-2］。灵芝（Ganoderma lucidum）是一种珍贵的食药用真菌，具有抗肿瘤［3］、保护心脑缺血［4］、抗病毒［5］和抗阿兹海默症［6］等药理作用。灵芝始载于《神农本草经》，《中华人民共和国药典》记载其为赤芝、紫芝的干燥子实体；
其中赤芝主治胸中结，可益心气、补中，对心脑血管疾病引起的心悸或者心律不齐等效果较好［7］。双向发酵是一种新的中草药发酵技术，中药在提供真菌生长所需营养的同时，又能受到真菌中酶的作用改变中药自身成分，产生新的性味功能，从而使整个发酵作用具有双向性［8-9］。在各项研究中发现这种发酵对中药材有解毒、增效和扩大适应症等作用［10-11］。
众多研究表明，灵芝菌作为双向发酵菌种具有很强的优越性，目前灵芝-中药双向发酵的研究主要集中于发酵物的化学成分测定及中药减毒增效等方面［12］。本课题组前期研究发现，巴豆经灵芝菌发酵后，其毒性成分脂肪油和毒蛋白的含量明显降低［13］，毒性也有了明显的下降［14］。但目前巴豆与灵芝双向发酵的研究只在于混合物，未对发酵前后含量变化的成分进行研究。
“灵巴菌质”为巴豆与灵芝双向发酵品。本研究在“灵巴菌质”中检测到腺苷，其含量与前期在巴豆中检测到的腺苷相比有所增加。腺苷（Adenosine）是由腺嘌呤的N-9与D-核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的内源性嘌呤类核苷［14］，其具有抗病毒、抗氧化［15］、调节中枢神经系统［16］、抗癫痫及保护心脏和肾脏［17］等作用。“灵巴菌质”中腺苷含量相对较低。因此，本研究对发酵工艺进行了优化，以期提高发酵品中腺苷的含量，同时对巴豆和发酵品“灵巴菌质”的抗氧化效果进行了评价。本研究为腺苷的开发及综合利用提供了参考。
1.1 材料与仪器
巴豆购于南京鹿江中药饮片厂，经南京中医药大学潘扬研究员鉴定为大戟科植物巴豆（Croton tig-liumL.）的果实；
多孔菌科真菌赤芝［Ganoderma lucidum（Curtis：
Fr.） P. Karst］由本实验室保存；
“灵巴菌质”为巴豆与灵芝菌的发酵品。葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、酵母提取液、琼脂、水杨酸、K3［Fe（CN）6］、C2HCl3O2、FeCl3、FeSO4均为分析纯，购自国药集团；
NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 购自上海凌峰化学试剂有限公司；
DPPH自由基清除能力试剂盒购自南京建成生物工程。
VS-1300L-V超净工作台（苏州净化设备有限公司）；
LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；
THZ-D恒温震荡器（太仓市实验设备厂）；
TD20002C电子天平（天津天马衡仪器）；
LHP-250H智能人工气候培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；
CS-700粉碎机（永康市天琪盛世工贸有限公司）；
EnVision多功能酶标仪（珀金埃尔默上海有限公司）；
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；
Agilent C18色谱柱（美国Agilent公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基
PDA培养基：土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L，121℃灭菌20 min，用于菌种扩大培养。
灵芝菌种子液：葡萄糖20.0 g，酵母粉5.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO41.5 g，蒸馏水1.0 L，121℃灭菌30 min，用于种子液的制备。
1.2.2 液体菌种制备
用接种针从活化的灵芝菌斜面上切取3～4块1 cm3菌块，接入种子液培养基的锥形瓶中，于180 r/min，28℃条件下培养6～7 d。
1.2.3 单因素实验
分别考察温度（22、25、28、31、34℃）、巴豆粉碎粒径（6、10、24、40、80目）、灵芝接种量（0.1、0.15、0.20、0.25、0.3 mL/g）、发酵时间（9、12、15、18、21、24、27、30 d）、初始含水量（50%、60%、70%、80%、90%、100%）、发酵pH（4、5、6、7、8）对腺苷产量的影响。若无特殊说明，固定水平为巴豆粉碎粒径为10目，接种量0.15 mL/g，温度28℃，初始含水量70%，发酵pH7，发酵30 d［18］。
1.2.4 Plackett-Burman实验
在单因素实验结果的基础上，以腺苷的含量为响应值，对发酵温度、巴豆粉碎粒径、接种量、发酵时间、初始含水量、发酵pH进行筛选，筛选出关键因子。每个因素取两个水平，分别用1和-1表示，共12组实验。实验因素水平及编码见表1。
表1 Plackett-Burman实验因素水平及编码Tab.1 Level and code of variables chosen for Plackett-Burman design
1.2.5 响应曲面优化
经过Plackett-Burman实验，筛选出发酵时间、pH、接种量及初始含水量为关键因素。随后以腺苷的含量为响应值，自变量为四个关键因素，进行4因素3水平的响应面分析实验。用Design Expert 10软件对Box-Behnken实验进行设计，并对实验结果进行响应面分析，最终确定最佳工艺参数。每个自变量的低、中、高水平分别用-1、0、1编码，Box-Behnken实验设计因素与水平见表1。
表2 响应面分析法实验设计因子水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.2.6 腺苷测定
待发酵结束后，将发酵产物“灵巴菌质”于60℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛。称取0.5 g灵巴菌质粉末，至于5 mL无菌管中，加入蒸馏水3 mL，于30℃、500 W超声提取3 h，冷却至室温，12 000 r/min离心5 min，分离得到上清液。将上清液经过0.22 μm微孔滤膜后经液相测定腺苷含量。以不同浓度腺苷溶液绘制标准曲线，确定回归方程为：y=41 116x+147.83，R2=0.999，具有良好的线性关系。
腺苷含量（mg/g）=（x - 147.83）/ 41 116 × 6
其中，x为峰面积。
液相条件：流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：5%A→10%A（0→15 min），10%A→15%A（15→25 min），15%A→20%A（25→30 min），20%A→30%A（30→35 min），30%A→95%A（35→40 min），95%A→5%A（40→50 min）［18］。流速为 1 mL/min，检测波长260 nm，进样量20 μL。
1.2.7 抗氧化测定方法
水提液：分别准确称取10 g巴豆和灵巴菌质粉末于三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，85℃超声提取两次，每次30 min，过滤，合并两次提取液，4℃保存备用。
醇提液：分别准确称取10 g巴豆和灵巴菌质粉末于三角瓶中，加入50 mL 75%乙醇，65℃超声提取两次，每次30 min，过滤，合并两次提取液，4℃保存备用。
1.2.7.1 还原力测定
取1 mL的样品，加入2.5 mL的浓度为0.2 mol/L，pH为6.6的磷酸缓冲液，摇匀后加入2.5 mL的1%铁氰化钾溶液。将混合物放入50℃水浴，恒温加热20 min后，加入1 mL 10%的三氯乙酸溶液。在2.5 mL的反应液中，加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL氯化铁溶液（0.1%）。在700 nm处测定吸光度值。溶液的吸光度值越高则还原性越强。
1.2.7.2 DPPH自由基清除率测定
根据DPPH自由基清除能力试剂盒，向离心管中加入不同比值的溶液，混匀，室温25℃避光静置30 min，4 000 r/min离心5 min，在波长517 nm下进行检测。
清除率（%）=［1 -（A测定 - A对照）/ A空白］×100%
1.2.7.3 羟基自由基清除率测定
吸取一定浓度的样品溶液1 mL，分别加入1 mL 9.0 mmol/L的FeSO4溶液1 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1 mL 8.8 mmol/L 的 H2O2、蒸馏水1 mL，置于37℃水浴中30 min，在510 nm波长处测定其吸光值A1；
用蒸馏水代替H2O2，得本底吸收A2，蒸馏水代替样品溶液，得空白值A3；
实验以蒸馏水作为参比。按照以下公式计算清除率。
清除率（%）=［1 -（A1 - A2）/ A3］× 100%
1.3 数据处理
所有实验均重复3次。通过GraphPad Prism 8对单因素实验的实验结果进行作图，采用SPSS 20.0进行差异显著性分析；
通过Design Expert 10软件对关键因子实验和响应面实验进行设计、数据处理、作图及方差分析。
2.1 单因素实验结果
2.1.1 发酵温度对腺苷含量的影响
随着温度的上升，腺苷的含量先上升后降低。在28℃发酵组中，其含量达到最高值，为1.39 mg/g（图1）。灵芝的最佳生长温度在28℃左右，超过最佳生长温度，灵芝菌丝体细胞中的蛋白质和核酸等将受到不可逆的破害，灵芝菌的生长受到影响［19］，从而灵芝与巴豆发酵不充分，导致腺苷含量较少。方差分析结果表明，发酵温度对腺苷含量具有显著影响（P＜0.05）。因此，选温度25～31℃作为关键因子筛选实验的水平范围。
图1 发酵温度对腺苷含量的影响Fig.1 The effects of fermentation temperatures on the contents of adenosine
2.1.2 巴豆粉碎粒度对腺苷含量的影响
在巴豆粒径为10目时，腺苷含量达到最高值，随后呈下降趋势（图2）。在固体发酵过程中，中药颗粒的大小会直接影响其与菌丝体的接触面积，以及发酵过程中氧供给率、CO2移除率以及散热率［20］。方差分析结果表明，巴豆粉碎粒度对腺苷含量具有显著影响（P＜ 0.05）。因此，选粉碎粒度6～24目作为关键因子筛选实验的水平范围。
图2 巴豆粉碎粒度对腺苷含量的影响Fig.2 The effects of crushing sizes on the contents of adenosine
2.1.3 灵芝接种量对腺苷含量的影响
在0.1～0.3 mL/g的范围内，腺苷的含量随着接种量的升高而显著增加。在接种量为0.25 mL/g时，其含量达到最高值，为1.61 mg/g，随后呈下降趋势（图3）。菌种接种量过大造成生长环境所提供的营养素不足，导致部分菌丝通过消耗自身的多糖来维持生命活动［21］，因此当菌种接种量提升时目标物质含量反而降低。方差分析结果表明，灵芝接种量对腺苷含量具有显著影响（P＜ 0.05）。因此，选接种量0.2～0.3 mL/g作为关键因子筛选实验的水平范围。
图3 接种量对腺苷含量的影响Fig.3 The effects of inoculation quantities on the contents of adenosine
2.1.4 发酵时间对腺苷含量的影响
不同的发酵时间对腺苷含量呈现出一定的影响，随着发酵天数增加，腺苷含量增加。在灵芝与巴豆双向发酵时间为27 d时，腺苷的产量达到最大值，为1.35 mg/g，当发酵天数大于27 d，腺苷的产量呈下降趋势（图4）。方差分析结果表明，发酵时间对腺苷含量具有显著影响（P＜ 0.05）。因此，选发酵时间24 ～30 d作为关键因子筛选实验的水平范围。
图4 发酵时间对腺苷含量的影响Fig.4 The effects of fermentation times on the contents of adenosine
2.1.5 初始含水量对腺苷含量的影响
在发酵过程中，不同的初始含水量对腺苷的含量有着明显的影响。初始含水量太少，灵芝菌的生长过程中得不到充足的水分，使得其生长缓慢，发酵不充分；
初始含水量过高，会产生灵芝菌不向瓶底生长的现象，也得不到充分发酵，从而导致腺苷含量较少，故初始含水量为80%最为适宜（图5）。方差分析结果表明，初始含水量对腺苷含量具有显著影响（P＜ 0.05）。因此，选初始含水量70%～90%作为关键因子筛选实验的水平范围。
图5 初始含水量对腺苷含量的影响Fig.5 The effects of initial moisture contents on the contents of adenosine
2.1.6 发酵pH对腺苷含量的影响
发酵pH为5.0时，腺苷的含量最高，此后其含量随着pH的升高而下降（图6）。分析原因可知，微生物的生长可能会受到pH的影响，灵芝菌一般生长于酸性条件下，最适pH为5.0～6.0。超过最适pH，灵芝菌丝细胞内的酶活性和细胞膜温度性受到影响，从而影响其对营养物质的吸收［22］，可能导致腺苷的生物转化率降低，含量减少。方差分析结果表明，发酵pH对腺苷含量具有显著影响（P＜ 0.05）。因此，选发酵pH4～6作为关键因子筛选实验的水平范围。
图6 pH对腺苷含量的影响Fig.6 The effects of pH on the contents of adenosine
2.2 关键因子的确定
用Minitab软件对表3中的数据进行多元回归分析，得到的回归方程为Y=1.548+0.048X1+0.016X2+0.141X3+0.066X4+0.156X5-0.053X6，R2=93.21%，表示该回归模型的拟合度好，R2adj=85.05%，表示模型适用于85.05%的效应值。
表3 Plackett-Burman实验设计及响应值Tab.3 Experimental design and response values of Plackett-Burman
由表4中的结果可知，影响腺苷含量的关键因素依次为：初始含水量X5＞接种量X3＞发酵时间X4＞发酵pHX6＞发酵温度X1＞巴豆粉碎力度X2。故选择初始含水量、接种量、发酵时间、发酵pH这四个关键因素进一步做响应面优化设计和分析。结合单因素结果，将发酵温度和巴豆粉碎力度这两个因素分别固定为28℃和10目。
2.3 响应面实验结果
Box-Behnken实验设计及结果见表5。通过Design-Expert 10软件对表4中的4个因素和腺苷含量Y进行数据拟合，得到Y对发酵时间（A）、pH（B）、接种量（C）及初始含水量（D）的多元回归方程：Y=2.074-0.015A-0.011B+0.013C+0.016D-0.01AC+0.01AD-0.005BC-0.0075BD-0.005CD-0.094A2-0.258B2-0.164C2-0.393D2。
表4 Plackett-Burman实验设计各因素效应评价Tab.4 Effect evaluation of each factor under the Plackett-Burman test design
表5 Box-Behnken实验设计及结果Tab.5 Design and results of Box-Behnken experiment
进一步对回归模型进行方差分析，结果见表6。模型F值为246.78，P＜0.000 1，表明回归模型是显著的，不同处理之间的差异也是极明显的。失拟项P=0.294 1＞0.05，表明失拟项不显著，回归方程模型与实际实验拟合性较好，误差较小。在回归模型中，一次项A、D、C对腺苷的产量影响显著（P＜ 0.05），二次项A2、B2、C2、D2对腺苷的产量影响极为显著（P＜ 0.000 1），而一次项pH（B）以及交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD对腺苷产量无显著影响。各因素对于腺苷含量的影响显著程度排序为：初始含水量（D）＞发酵时间（A）＞接种量（C）＞pH值（B）。
表6 回归模型方差分析Tab.6 Regression model analysis of variance
由Design-Exper 10软件对回归模型进行优化分析得到腺苷产量的最佳条件为：发酵时间27 d，pH5，接种量为2.5 mL/10 g，初始含水量为80%，在此条件下，预测所得到的腺苷最大理论值为2.1 mg/g。
2.5 最佳工艺的验证
根据上述的最佳工艺条件，再结合发酵温度为28℃，巴豆粉粹粒径为10目，本实验进行了3次平行的验证实验，得到腺苷的平均含量为2.07 mg/g，标准差为0.028。这与预测值2.1 mg/g相对误差较小，差异不显著，表明模型建立良好。
2.6 抗氧化结果
2.6.1 还原力
在巴豆和“灵巴菌质”水提取物浓度为50 mg/mL时，巴豆水提物的还原力为0.712，“灵巴菌质”水提物的还原力为0.909，“灵巴菌质”水提物的还原力明显强于巴豆水提物（图7-A）。在30～60 mg/mL浓度范围内，“灵巴菌质”醇提物的还原力增长较快，而巴豆醇提物的还原力增长较缓慢，且前者的还原力始终大于后者（图7-B）。
图7 巴豆和“灵巴菌质”的还原力Fig.7 Reducing power of C.tiglium and “Lingba Junzhi”
2.6.2 DPPH自由基清除能力
在浓度为60 mg/mL时，“灵巴菌质”水提物的DPPH自由基清除率为94.60%，IC50为10.80 mg/mL；
巴豆水提物的DPPH自由基清除率为71.15%，IC50为20.56 mg/mL；
“灵巴菌质”醇提物的DPPH自由基清除率为85.12%，IC50为11.25 mg/mL；
巴豆醇提物的DPPH自由基清除率为49.06%，且未达到IC50抑制水平（图8）。可见，“灵巴菌质”的DPPH自由基清除能力优于巴豆。
图8 巴豆和灵巴菌质的DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH scavenging rate of C. tiglium and “Lingba Junzhi”
2.6.3 羟自由基清除能力
在浓度为60 mg/mL时，“灵巴菌质”水提物的羟自由基清除率为69.87%，IC50为31.82 mg/mL；
巴豆水提物的羟自由基清除率为57.58%，IC50为54.43 mg/mL；
“灵巴菌质”醇提物的羟自由基清除率为60.73%，IC50为45.47 mg/mL；
巴豆醇提物的羟自由基清除率为48.29%，且未达到IC50抑制水平。可见，“灵巴菌质”的羟自由基清除能力优于巴豆，水提物的羟自由基清除率大于醇提物（图9）。
图9 巴豆和灵巴菌质的羟自由基清除率Fig.9 Hydroxyl radicals scavenging of C. tiglium and “Lingba Junzhi”
本试验在“灵巴菌质”中检测到腺苷，其含量与前期在巴豆中检测到的相比，有所增加。但与冬虫夏草和蛹虫草中的腺苷含量相比，“灵巴菌质”中腺苷含量相对较低［23-24］。因此本试验对增加“灵巴菌质”中腺苷的含量进行了发酵工艺优化，得到最佳发酵条件：发酵时间27 d，pH5，接种量为0.25 mL/g，初始含水量为80%，发酵温度为28℃，巴豆粉碎粒径为10目，在此条件下的腺苷的含量为2.07 mg/g。与初始发酵工艺所得到1.10 mg/g相比，腺苷的含量提高187.8%，优化效果显著，表明对其生产具有一定的实用价值。
本试验也对巴豆和“灵巴菌质”的抗氧化活性进行研究，结果表明“灵巴菌质”的水提取物和醇提取物的还原力、DPPH自由基清除率和羟自由基清除率均强于巴豆。可能是因为发酵期间灵芝次生代谢产生的各种酶使基质中的有效成分暴露出来了所导致的。
以上仅是本课题现阶段的研究成果，还存在着腺苷具有较强的抗氧化活性，“灵巴菌质”抗氧化能力增强是否与腺苷相关，或与其他哪些成分相关等不足。本试验结果提供了一种高效提高巴豆-灵芝发酵品中腺苷含量的方法，为腺苷的工业化生产提供一定的理论基础，也为进一步深度开发巴豆资源提供了一种新思路，为提高巴豆利用率和价值提供了科学依据。
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