廖婉婷，潘文疆，陈明珠，林少梅，梁荣生
(1.泉州医学高等专科学校药理学教研室，福建 泉州 362000；
2.晋江市医院血管介入科，福建 晋江 362200)
类风湿关节炎(rheumatic arthritis,RA)是一种慢性、全身性且临床常见的自身免疫性疾病，临床主要表现为多关节疼痛、肿胀、畸形，甚至功能丧失[1]。目前，RA发病机制尚未完全清楚。大量研究表明，抑炎因子与促炎因子动态平衡的失调在RA的发生、发展进程中发挥关键性的作用[2-3]。目前，常见治疗RA的非甾体类抗炎药物、抗风湿药物、糖皮质激素等的疗效和安全性较低[4]，因此，亟待开发安全、有效的抗RA药物。完全弗氏佐剂诱导的佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型在临床表现、病理学和免疫学改变方面与RA有很多相似特征，常作为经典的实验动物模型用于研究RA的病理机制和治疗药物[5]。七叶莲性温、味苦，有抗炎、镇痛、催眠等功效，对坐骨神经痛、三叉神经痛、胃溃疡和十二指肠溃疡疼痛以及RA有良好的疗效[6-7]。基于此，本研究旨在探讨七叶莲对AA大鼠的治疗效果，及其对血清白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)水平的影响，以期明确七叶莲治疗RA的可能机制，为其在临床RA治疗中的应用提供依据。
1.1 实验动物健康雄性清洁级Sprague Dawley大鼠50只，购自上海斯莱克实验有限责任公司[许可证号：SCXK(沪)2019-0002]，体质量150～210 g，饲养于泉州医学高等专科学校清洁级实验动物房，室温23～25 ℃，湿度45%～65%，自由摄食和饮水，垫料每日更换1次。
1.2 主要药物、试剂与仪器七叶莲片购自泉州中侨药业有限公司(国药准字 Z35020528)，吲哚美辛购自上海国药集团化学试剂有限公司，乌来糖溶液购自北京化学试剂公司，弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司；
大鼠IL-4、IL-10、TNF-α酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自美国RD公司；
电子天平购自上海良平仪器仪表有限公司，低温离心机购自德国赛多利斯公司，数显游标卡尺购自青岛易购五金工具有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组、模型建立及干预措施将50只大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组，每组10只。模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠制备AA模型。具体造模方法：大鼠腹腔注射质量分数200 g·L-1乌来糖溶液(5 mL·kg-1)麻醉，于大鼠左后足趾皮内用微量注射器注射弗氏完全佐剂100 μL，分3处注射，具体为足趾垫下2处，足趾背部1处，诱导大鼠产生炎症反应，14 d后，大鼠出现明显关节红肿，关节炎指数(arthritis index，AI)评分>5分为造模成功[8]。造模成功后，吲哚美辛组大鼠给予2.5 mg·kg-1吲哚美辛灌胃作为阳性对照，低剂量七叶莲组和高剂量七叶莲组大鼠分别给予10.0、25.0 mg·kg-1七叶莲灌胃，正常对照组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，均每日1次，连续给药10 d。
1.3.2 各组大鼠一般情况观察实验期间观察各组大鼠进食、饮水、皮毛、关节肿胀等一般情况。
1.3.3 大鼠关节炎病变程度评分分别于造模后及给药2、5、8、10 d时，采用AI评分[9]评估模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组和高剂量七叶莲组大鼠全身关节炎病变程度。AI评分为5级评分法：0分为无红肿；
1分为小趾关节红肿；
2分为趾关节和足跖红肿；
3分为踝关节以下红肿；
4分为包括踝关节在内的全部足爪红肿。累计大鼠四肢的AI评分，最高16分，分数越高表示关节炎病变程度越严重。
1.3.4 大鼠足肿胀度测量分别于造模前、造模后及给药2、5、8、10 d时，使用游标卡尺测量各组大鼠后足跖厚度，以后足跖厚度表示大鼠足跖肿胀度。用自制大鼠固定器限制大鼠活动，用手轻柔拉直大鼠左后肢，用黑色记号笔在大鼠后足跖测量处进行标记，用游标卡尺测量后足跖厚度，测量3次，取均值。
1.3.5 ELISA法检测大鼠血清中IL-4、IL-10和TNF-α水平给药10 d后，各组大鼠腹腔注射质量分数200 g·L-1乌来糖溶液(5 mL·kg-1)进行麻醉，取腹主动脉血5 mL，使用低温离心机4 000 r·min-1离心10 min，取血清，于-80 ℃冰箱保存备用。使用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中IL-4、IL-10、TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.1 5组大鼠一般情况比较实验期间，正常对照组大鼠进食、饮水正常，皮毛整洁，神态活泼，无关节肿胀；
模型组大鼠进食、饮水量下降，活动减少，精神倦怠，局部关节肿胀明显，甚至出现溃烂；
七叶莲高剂量和低剂量组大鼠给药6 d后，进食、饮水逐渐增加，神态良好，局部出现的溃烂开始结痂；
吲哚美辛组上述表现较模型组也有改善。
2.2 模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组和高剂量七叶莲组大鼠AI评分比较结果见表1。造模后及给药2、5 d时，模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠的AI评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药8、10 d时，吲哚美辛组和高剂量七叶莲组大鼠AI评分显著低于模型组(P<0.05)。给药8、10 d时，低剂量七叶莲组与模型组大鼠的AI评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药8、10 d时，吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠AI评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后及给药2、5、8、10 d时，模型组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠AI评分组内各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后及给药2、5、8 d时，吲哚美辛组大鼠AI评分各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。吲哚美辛组大鼠给药10 d时AI评分显著低于造模后、给药2 d 时，差异有统计学意义(P<0.05)；
吲哚美辛组大鼠AI评分给药10 d时与给药5、8 d时比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组和高剂量七叶莲组大鼠AI评分比较
2.3 5组大鼠后足跖厚度比较结果见表2。造模前，5组大鼠后足跖厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后及给药2、5、8、10 d时，模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠后足跖厚度均显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。给药5、8、10 d时，吲哚美辛组、高剂量七叶莲组大鼠后足跖厚度均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。给药8 d时，低剂量七叶莲组大鼠后足跖厚度显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。造模后及给药2 d时，模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠后足跖厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药5、10 d时，低剂量七叶莲组与模型组大鼠后足跖厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药5、8、10 d 时，吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠后足跖厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表2 5组大鼠后足跖厚度比较
正常对照组大鼠造模前、造模后及给药2、5、8、10 d的后足跖厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠造模后及给药2、5、8、10 d时的后足跖厚度均显著低于造模前，差异有统计学意义(P<0.05)。造模后及给药2、5、8、10 d时，模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠的后足跖厚度组内两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4 5组大鼠血清中IL-4、IL-10和TNF-α水平比较结果见表3。模型组大鼠血清中IL-4水平显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-4水平显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-4水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表3 5组大鼠血清中IL-4、IL-10和TNF-α水平比较
模型组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组大鼠血清中IL-10水平显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。吲哚美辛组、高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-10水平显著高于模型组、低剂量七叶莲组，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组与高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组与低剂量七叶莲组大鼠血清中IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。吲哚美辛与高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。
模型组大鼠血清中TNF-α水平显著高于正常对照组、高剂量七叶莲组，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠血清中TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。
七叶莲作为传统的民间中草药，具有广泛的药理活性，有祛风止痛、活血化瘀、舒筋活络等功效，民间常将其叶子捣烂外敷用于骨折及出血性疼痛[10]。有研究证实，七叶莲的提取物具有显著的镇痛、抗炎、免疫抑制等作用，临床可用于治疗风湿病[11]。吲哚美辛可抑制前列腺素的释放，有效缓解RA疼痛及局部症状[12]，在本研究中作为七叶莲治疗AA大鼠的阳性对照试剂。本研究结果显示，模型组大鼠进食、饮水量下降，活动减少，精神倦怠，局部关节肿胀明显，甚至出现溃烂；
高剂量七叶莲组和低剂量七叶莲组大鼠给药6 d后，进食、饮水逐渐增加，神态良好，局部出现的溃烂开始结痂；
吲哚美辛组上述表现较模型组也有改善；
说明七叶莲可改善AA大鼠的一般情况。本研究结果显示，给药8、10 d时，吲哚美辛组和高剂量七叶莲组大鼠AI评分显著低于模型组，说明给药8、10 d时高剂量七叶莲可显著改善AA大鼠的关节炎病变程度。此外，本研究结果显示，给药5、8、10 d时，吲哚美辛组、高剂量七叶莲组大鼠足肿胀度均显著低于模型组；
吲哚美辛组、低剂量七叶莲组、高剂量七叶莲组大鼠后足跖厚度组内两两比较差异无统计学意义；
说明给药8、10 d时高剂量七叶莲可显著改善AA大鼠的足肿胀度。本课题组前期研究发现，七叶莲可显著降低AA大鼠炎症细胞浸润，减轻软骨细胞组织的破坏，明显改善炎症程度[13]。
目前，RA的发病机制尚未完全清楚。有研究认为，RA患者体内的T细胞功能异常表现为辅助T细胞(helper T cell，Th)1和Th2的失调，并引起促炎因子和抑炎因子水平的失衡[14]。IL-4是由活化的Th2分泌产生的细胞因子，在RA的发生和发展中扮演着抑炎因子的作用[15]，具体作用机制为：(1)IL-4促进巨噬细胞黏附到血管内皮细胞并逸出血管，进而沿趋化梯度移动到炎症部位；
(2)IL-4可通过促进Th2的扩增和抑炎因子的释放，抑制IL-2、IL-8和TNF-α的释放，从而抑制Th1介导的免疫应答，起到改善RA的作用[16-17]。IL-10是由Th2、肥大细胞等多种细胞分泌的细胞因子，可发挥免疫抑制的作用，抑制中性粒细胞、单核细胞分泌TNF-α、干扰素-γ等致炎细胞因子；
抑制单核细胞表达主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子抗原和CD80、CD86等协同刺激因子，减弱抗原提呈功能，发挥抗炎作用[18-20]。TNF-α是活化的Th1分泌的细胞因子，不仅是一种有效的肿瘤细胞杀伤因子，还是RA发病中重要的促炎细胞因子，过表达可引起慢性炎症[21]。本研究结果表明，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中IL-4、IL-10水平显著下降，TNF-α水平显著升高；
高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-4、IL-10水平显著高于模型组，TNF-α水平显著低于模型组；
高剂量七叶莲组大鼠血清中IL-4、IL-10、TNF-α水平与吲哚美辛组比较差异无统计学意义；
其原因可能为：AA大鼠 Th2细胞分泌的抑炎因子明显占劣势，Th1细胞分泌的促炎细胞因子明显占优势，导致Th1/Th2细胞分泌的细胞因子出现明显的失衡，Th1/Th2的平衡向Th1偏移，细胞因子网络的平衡受到破坏。高剂量七叶莲通过上调AA大鼠血清中Th2细胞因子IL-4、IL-10的表达，发挥免疫抑制和免疫调控作用，减轻AA大鼠的关节肿胀度、降低AI指数，抑制关节炎症细胞浸润，这可能是其治疗RA的作用机制之一；
下调血清中TNF-α水平，抑制Th1细胞反应，提高Th2细胞的优势，促进AA大鼠体内Th1/Th2平衡的恢复，纠正RA的炎症损害，这可能是七叶莲治疗RA的又一作用机制。
综上所述，高剂量七叶莲可显著改善AA大鼠的关节炎病变程度和足肿胀度，机制可能与其对血清中IL-4、IL-10、TNF-α水平的调控有关。但对于复杂的细胞因子网络，本研究还未能全面地解释七叶莲对RA治疗中复杂的免疫调节作用，下一步的研究重点为通过基因芯片技术，全面检测全基因表达谱的改变，以期寻找位于网络中心的信号通路和基因，进一步明确RA的发病机制，为应用七叶莲治疗RA打下扎实的理论基础。
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