赵梦雪，喻正科，赵启，李珊珊，陈静
1 湖南中医药大学 湖南长沙 410006
2 湖南省中医药研究院附属医院 湖南长沙 410006
慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于各种原因导致的心脏收缩或舒张功能异常，无法满足身体的代谢需求，由此产生的一系列症状和体征的临床综合征[1]。据统计，我国心血管疾病现患人数高达3.3亿，其中心力衰竭890万例[2]。流行病学调查显示，65岁以上人群心衰发病率高，死亡率和再住院率居高不下[3-4]，预计未来20年内，心衰的患病率将增加25%[5]，全球负担将急剧增加。目前西医治疗心衰主要以强心、利尿、扩血管、拮抗神经内分泌激活及改善心室重构为主，主要针对心脏本身症状，不能解决心衰常见的伴发症状，大量临床及实验证明中医药可以通过多方面、多靶点的相互作用对慢性心力衰竭进行调控和改善，由此体现出其显著优势和广阔前景[6]。
参竹心康方是湖南省名中医喻正科教授的临床经验方，由党参、麦冬、黄芪、五味子、丹参、玉竹、三七、黄精、红花、泽兰、姜黄、葶苈子12味中药组成，主要针对慢性心力衰竭气阴两虚，瘀血内阻这一主要病机，既往多项研究均证实参竹心康方对慢性心力衰竭疗效显著，能够降低心力衰竭患者胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性；
改善血管内皮依赖性舒张功能；
减轻心肌纤维化、改善心室重构等[7-13]。在不断完善的计算机技术的支持下，网络药理学蓬勃发展，日益成熟，揭示出药物成分在疾病转归中发挥的作用，其构建的网络关系与中医学理论体系中整体观念这一基本特点相契合[14]。本研究采用网络药理学方法，从物质基础和分子水平探索参竹心康方治疗CHF的作用机制，为其临床应用提供科学依据。
1 参竹心康方活性成分及相关靶点筛选
通过检索TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），寻找中药化学组成成分，以OB≥30%且类药性DL≥0.18两个ADME属性值作为靶点筛选标准。将所获蛋白质靶点在Uniprot蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）中完成基因名称的转化。检索 ETCM 数 据 库（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）筛选补充TCMSP中未收录的中药—麦冬的化学成分，在化源网（https：//www.chemsrc.com/）中获取化学成分 CAS号，利用 PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查询麦冬化学成分的2D结构及SMILES 结构式，导入SwissADME数据库（http：// www.swissadme.ch/）后，分析其胃肠道吸收利用度（gatrointestinal absorption，GA）及 DL，筛选条件：GA 值为“High”、DL5项（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、 Muegge）中“Yes”≥ 2 项。将筛选出的活性成分的2D结构导入SwissTargetPrediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），选择“homo sapiens”为物种信息，预测作用靶点，筛选条件：probability>0，完成麦冬活性成分作用靶点的筛选。
2 构建参竹心康方“活性成分-靶点”网络
将参竹心康方活性成分及靶点文件分别导入Cytoscape3.7.1软件，构建参竹心康方“活性成分-靶点”网络，利用Network Analyzer功能做进一步分析，获得具体特征数据及关系网络。
3 慢性心力衰竭相关靶点筛选
以“chronic heart failure”为检索关键词，在 Dis-GeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/）、DrugBank数 据 库（https：//go.drugbank.com/）、OMIM 数 据 库（https：//omim.org/）、GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）中寻找CHF的潜在靶点，根据经验以“Score”值为GeneCard 数据库筛选依据，设置Score值大于中位数，合并各疾病数据库靶点，删除重复值得到CHF靶点。
4 参竹心康方治疗慢性心衰共同靶点的筛选
利用在线韦恩分析工具（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）绘制参竹心康方活性成分与CHF相关靶点韦恩图并获取交集靶点。
5 蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选
将参竹心康方与CHF交集靶点导入STRING（https：//string-db.org/）数据库，构建 PPI网络，选择人类物种，设置置信度>0.4，得到PPI网络图，将PPI网络数据以TSV格式保存，在Cytoscape3.7.1中进行可视化处理，以节点连接度（Degree）为指标，筛选Degree排名前6的靶点为核心靶点[15]。
6 通路富集分析
Metascape 平 台（http：//metascape.org/gp/index.html）数据全面可靠，是目前最权威的数据平台之一。将参竹心康方与CHF共同靶点导入Metascape平台，分别进行信号通路富集（KEGG）分析和基因功能分类（GO），设置P<0.01，应用微生信平台（http：//www.Bioinformatics.com.cn）将结果进行KEGG 通路富集分析气泡图和GO生物功能分析柱状图的绘制。
1 参竹心康方活性成分及相应靶点
利用TCMSP数据库，根据筛选标准，共得到158个有效成分，其中黄芪17个，玉竹5个，丹参54个，三七7个，黄精9个，红花15个，泽兰2个，姜黄3个，葶苈子9个，麦冬12个，五味子8个，党参17个。
检索出靶点1688个，其中黄芪213个，玉竹18个，丹参136个，三七184个，黄精85个，红花205个，泽兰44个，姜黄32个，葶苈子188个，麦冬457个，五味子19个，党参107个，去除重复靶点后，共得到618个药物靶点。
2 参竹心康方“活性成分-靶点”网络构建和分析
利用 Cytoscape 3.7.1绘制出参竹心康方活性成分及靶点的互作网络并进行Network Analyzer分析后，共获得776个节点（包含618个靶点和158个活性成分）与4016条关系（图1）。根据Degree值，由高到低将参竹心康方的部分活性化合物进行排序（表1）。这些化合物分别为：槲皮素、β- 谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、N-反式-阿魏酰酪胺、甲基麦冬黄烷酮B、常春藤皂苷元、黄芩苷、异鼠李素等。
表1 参竹心康方核心活性成分信息
图1 “活性成分—靶点”网络图
3 慢性心衰疾病靶点
检索 DisGeNET、DrugBank、OMIM、GeneCards数据库，得到慢性心衰靶点个数分别为224、13、577、1325，筛选汇总以上数据库靶点，去除重复项，获得1913个疾病靶点。韦恩图结果显示，药物与疾病交集靶点为206个（图2）
图2 药物靶点和疾病靶点分布图
4 靶点蛋白的交互作用网络
由PPI网络图（图3）可知，该网络由206个节点及4684条相互作用的边组成。选取节点度值为评价指标，数值越大表明其在此网络中越重要，在生物学功能中发挥的作用也更加突出；
从颜色来看，节点度值由大到小，其节点颜色由蓝绿黄橙依次渐变。排名前六的靶点为 AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53、IL1B，这些就可能是参竹心康方治疗CHF的关键靶点。
图3 参竹心康方对慢性心衰作用靶点的蛋白互作网络图（Degree>20）
5 GO生物功能和 KEGG 通路富集分析
将参竹心康方与CHF共同靶点导入Metascape平台，进行 GO 生物功能分析和 KEGG 通路富集分析，获得 GO 生物功能条目2791 条，其中生物过程有2428条，主要涉及激酶活性的调节、对无机物的反应、细胞对氮化合物的反应、细胞迁移的正向调节、凋亡信号通路的调控等；
细胞组分共139 条，主要涉及膜筏、囊泡腔、受体复合物、细胞质核周区、转录调节复合物等；
分子功能224条，主要涉及蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质结构域特异性结合、激酶结合、细胞因子受体结合等。KEGG通路富集分析共获得204 个信号通路，主要涉及癌症的途径、AGERAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路、Th17细胞分化、糖尿病性心肌病、钙信号通路、cAMP信号通路、肿瘤转录失调、cGMP-PKG信号通路等。见图4-5及表2。
表2 复方作用靶点KEGG分析
图4 参竹心康方治疗慢性心衰活性成分-疾病共同靶点 GO 分析
心衰病名最早出现在宋·赵估所编《圣济总录·心脏门》，根据疾病特点，多将本病归属于中医学“脱证”“心悸”“喘息”“水肿”“痰饮”“心痹”等范畴，总以本虚标实，本虚乃气虚阳虚，突出心肾；
标实为痰、水、瘀，三者同为病因又作为病理产物互相影响[16]。参竹心康方针对慢性心力衰竭常见之气阴两虚，瘀血内阻的病机组方，以党参、麦冬为君，相辅相成，益气养阴。黄芪、五味子补益心肺，配伍党参助心肺鼓动血脉；
玉竹与麦冬合用，更滋心阴，丹参、三七活血化瘀，黄精补气养阴，以上六味同为臣药。红花、泽兰佐助臣药丹参、三七活血通脉，葶苈子泻肺平喘利水，以上三味共为佐药。诸药合用则中气鼓舞，心肺气血充沛，气行则瘀血化，全方共奏气血同治、补泻兼施之功[17]。
本研究通过分析“复方-活性成分-靶点”网络，选取Degree值作为标准预测出参竹心康方治疗CHF的主要成分为：槲皮素、β- 谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、N-反式-阿魏酰酪胺、甲基麦冬黄烷酮B、常春藤皂苷元、黄芩苷、异鼠李素等。槲皮素作为黄酮类化合物在自然界分布广泛，研究发现其在多个系统的疾病中都发挥了药用价值，在心血管方面，作用包括抗心肌纤维化、改善心功能、保护血管内皮、减轻心肌炎性损伤、纠正心室重构以及抗血小板聚集等[18]。山奈酚对心脏成纤维细胞的增殖与活化具有明显抑制作用，可以调节ASK1/MAPK信号通路的传导预防心脏肥大，机制涉及对ROS水平、细胞色素C释放的调节以及对线粒体膜电位的维持等[19-20]。木犀草素具有显著的心血管疾病相关益处，能够降低心肌缺血再灌注造成的损伤，并且能够有效抑制炎症反应，发挥对心力衰竭的保护作用。阿霉素诱导的大鼠心衰实验表明[21]，长期的木犀草素治疗能够部分逆转心室重塑改善心功能，其作用机制与抑制TNF-α诱导的ROS的生成、降低NOX4、p22phoxex的表达、增强心肌肌浆网 Ca2+ -ATP 酶（SERCA2a）的转录活性等密切相关[22-23]。黄芩苷可抑制心肌纤维化，抑制MMP2 和 MMP9 的表达和活性，以及心脏组织中的凋亡。在心肌缺氧时，可产生ROS，减轻氧化应激反应，使心肌细胞存活，通过下调Ca（2+）/CaMKII的磷酸化和SERCA2和RYR2的上调等起到减轻心肌重塑并改善心功能的作用[24]。异鼠李素具有多种生物活性，在心血管方面，具有抑制血管平滑肌、心肌细胞增生肥大、抗炎、抗栓等多种作用[25]。
图5 参竹心康方治疗慢性心衰活性成分-疾病共同靶点KEGG分析
本研究所得靶点按照度值排名，较为重要的有 AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53、IL1B、EGFR、CASP3、JUN、CTNNB1。AKT可以调节心肌生长、心肌血管生成、葡萄糖代谢和心肌细胞死亡。
AKT1作为AKT的亚型，广泛存在于机体各组织中。研究表明，AKT1通过激活血管内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）促进细胞存活；
通过促进Ser9磷酸化使糖原合成酶激酶3β（GSK3β）蛋白失活防止细胞凋亡；
通过上调基质金属蛋白酶（MMPs）的水平实现对内皮细胞增殖与迁移的调控；
还能抑制RPS6KB1信号传导增强细胞自噬等，在多种生物学过程中发挥重要作用[26，27]。VEGFA是血管通透性和血管生成的主要调节剂，还可以激活参与心肌收缩和新陈代谢的基因的表达。研究表明，VEGFA在心脏疾病的病理过程中作用显著，通过与心肌基质细胞衍生因子-1（SDF-1）一起促进心肌梗死内的心脏干细胞动员和心肌修复；
在心衰中，通过功能性上调诱导血管生成，建立侧支循环保护心肌；
通过促进NO、PGI2的生成，共同发挥参与血管内皮修复、保护内皮功能、抑制平滑肌细胞增殖的作用，延缓心衰进展；
通过其在血栓调控中的双重作用，改变凝血机制，使凝血与抗凝机制在心衰病程中趋于平衡[28]。IL-6是炎症因子之一。研究发现，长期持续的IL-6信号会使心肌收缩力下降，左室增大，肥大基因发生逆转，诱发心衰，此过程为IL-6结合IL-6受体后，激活信号转导受体复合物gp130，该复合物与IL-6受体结合产生的下游信号，通过RAS-MAPK、JAK-STAT或PI3K通路，参与心血管疾病的发生发展[29]。TNF是炎性反应相关的细胞因子，分为TNF-α、 TNF-β 两种，TNF-α 是最有效的促炎细胞因子之一，被选作细胞因子靶向入路的首要靶点。研究表明TNF-α在心脏疾病中体现出复杂性的特征，更多地发挥对心脏的保护作用，机制可能与缺氧状态下TNFR2的高表达促进心肌细胞的增殖相关[30]。TP53作为一种转录因子，可调节许多负责DNA修复、细胞代谢与迁移、血管的生成与衰老和凋亡基因的表达。除抑制肿瘤生成外，还可以作为成纤维细胞转化为内皮细胞的开关，减少心脏病发作后形成的瘢痕，进而改善心功能[31]。
KEGG富集分析结果显示，与参竹心康方治疗CHF密切相关的通路主要包括：PI3K-Akt 信号通路、JAK-STAT信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路等。P13K-Akt通路对于调节心肌细胞的凋亡、代谢、减少氧化应激及血管再生等具有重要作用，研究表明，PI3K 的启动可以募集Akt并促进其磷酸化，活化后的Akt通过多种途径增强血管生成、抑制细胞凋亡因子、调节钙离子浓度，对心肌细胞的凋亡起到抑制作用[32-33]。JAK-STAT 信号通路在心脏病理生理学中起核心作用。JAK-STAT 信号传导与压力过载诱导的心脏肥厚和重塑、缺血预处理和缺血/再灌注诱导的心脏功能障碍相关。STAT3作为STAT的家族组分之一是JAK的重要底物，具有抗炎、抗凋亡的作用[34]，其发挥作用的机制为心肌缺血期间STAT3的磷酸化增加，促使凋亡相关基因bax及caspases的表达增加[35]。众多研究表明，在心力衰竭这一疾病进程中会出现钙信号通路的异常，随着舒张期肌浆网功能失常，钙离子会大量流漏，钙离子稳态失常，导致心肌收缩力降低，引发心脏重构。cAMP通过β-AR信号传递产生，并通过AMP水解酶磷酸二酯酶（PDE）抑制，cAMP的增加导致cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）和Epac的激活，研究表明，这些蛋白质可以激活钙处理蛋白、RyRs和SERCA2a，由此达到维持心肌钙稳态及心肌收缩舒张功能、抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌损伤的作用。[36]。cGMP-PKG信号通路对心脏收缩与舒张功能具有调控作用，进而对心室重构产生影响，这一作用通过调节钙离子浓度来实现[37]。
综上所述，本研究利用网络药理学方法对参竹心康方治疗慢性心力衰竭过程中的机制进行探索。通过对活性成分、作用靶点及信号通路的研究，推测出参竹心康方可能是通过复方中槲皮素、山奈酚、木犀草素、黄芩苷、异鼠李素等关键活性成分，结合AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53等 核 心 靶 点，通 过 调 控PI3K-Akt、JAK-STAT、钙、cAMP、cGMP-PKG 等信号通路来发挥对慢性心力衰竭的治疗作用。这体现出参竹心康方多通路、多靶点联合作用的特点，为今后深入研究其药理作用提供方向和参考，预测结果有待细胞及动物实验等进一步验证。
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