胡浪，施巍巍，周亚杰，王颖，冯鹏，郭原
（南京中科药业有限公司，江苏 南京 210008）
缺血性脑卒中（ischemic stroke）指多种原因引起的短暂或永久脑血流供应障碍，脑组织缺血缺氧坏死，导致神经功能缺损，产生包括偏瘫、失语、认知和学习能力受损等一系列临床综合征。缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高以及并发症多等特点[1]。缺血性脑卒中属于脑卒中多种亚型中的主要类型，已成为世界第二大死亡原因和第三大致残因素[2,3]。目前对于缺血性脑卒中的治疗手段包括手术介入治疗和药物治疗。其中，药物治疗是临床上最常用的手段，如抗凝药、抗血小板药和溶栓药[4,5]。然而这些现存的药物存在药物选择性不高、作用途径单一及胃肠道反应明显等缺点，因此，寻找新的候选药物对于防治缺血性脑卒中具有着重要的意义[6]。
大脑中动脉（Middle cerebral artery,MCA）是人类脑卒中的多发部位，大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型。
灵芝作为一种名贵的中药材，以子实体入药，含有多种氨基酸、脂肪酸、三萜和多糖类等物质。灵芝子实体醇提物是从灵芝子实体中经乙醇提取后得到的提取物，其主要成分有灵芝多糖、灵芝总三萜和氨基酸等[7]。多篇文献报导灵芝醇提物具有提高免疫力、辅助抑制肿瘤及改善睡眠的作用[8-10]。
本研究建立MCAO/R模型，探索大鼠脑缺血再灌注损伤的抗凝血作用及治疗作用，为灵芝子实体醇提物的进一步开发提供实验依据。
1.1 药物与试剂
灵芝子实体醇提物（南京中科药业有限公司），临用前用玉米油配成所需浓度的均匀混悬液；
氯吡格雷，临用前0.5%CMC-Na配成所需浓度的均匀混悬液。0.9%氯化钠注射液（安徽双鹤药业有限责任公司产品）；
水合氯醛（上海凌峰化学试剂有限公司产品），临用前用0.9%氯化钠注射液溶解配制成浓度为3%的澄清溶液。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，BioLINK公司），临用前用PBS缓冲液配制成浓度为1%的溶液；
羧甲基纤维素钠（CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司），0.5%CMC-Na的配制：将2.5 g CMC-Na均匀撒在500 mL的超纯水表面，室温下放置过夜，摇匀后使用，药用级玉米油（Aladdin）。
1.2 动物
SD大鼠，72只，SPF级，雄性，由上浙江省杭州医学院提供，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，合格证编号：20201010Aazz0100000536；
ICR小鼠，50只，SPF级，雌雄各半，由浙江省杭州医学院提供，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，合格证编号：202009 22Abzz0100000176，20200922Abzz0100000485；
饲料：颗粒饲料，由中国药科大学动物室供给；
饲养条件：空调房间，温度18~24℃，相对湿度70%。所有动物试验均符合动物伦理委员会标准。
1.3 仪器
数显干燥箱（上海博讯实业有限公司GZX-9140 MBE）；
电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司BS224s型）；
数显恒温水浴锅（国华电器有限公司产品HH-4）；
20℃冰箱（德国SIEMENS公司BCD-254CKK 25V61TI）。
2.1 灵芝子实体醇提物的制备方法
取灵芝子实体粗粉碎，用30倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h，收集滤液，真空干燥4 h，粉碎过筛，即得灵芝子实体醇提物。
2.2 灵芝子实体醇提物于MCAO再灌后2 h给药对大鼠脑缺血损伤的保护作用
2.2.1 大鼠MCAO/R损伤模型建立取雄性SD大鼠36只（实际需要72只，因为成模率为50%左右），体重250~300 g，按体重随机分为6组，每组6只，分为醇提物高剂量组（20 mg/kg）、中剂量组（10 mg/kg）和低剂量组（5 mg/kg）3个剂量组，阳性对照氯吡格雷组7.5 mg/kg，假手术组及缺血模型对照组（均给以等容积的生理盐水）。MCAO再灌后2 h开始给药，每日灌胃给药1次，连续给药7 d，给药容积为0.2 mL/100 g体重。
渔线的制备：将一长40 mm，直径0.26 mm的渔线的一端用记号笔标记，在距离此标记端18 mm处用记号笔再做一标记，置于生理盐水中备用。
大鼠MCAO/R模型：造模手术前24 h禁食不禁水。参考Longa等的方法[11]，采用颈内动脉线栓法制备大鼠MCAO模型：大鼠用3%水合三氯乙醛（300 mg/kg）腹腔注射（i.p）麻醉，仰卧手术台上，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉，将渔线（长40 mm，直径0.26 mm）经颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，当渔线进入颈内动脉后松开颈内动脉上的动脉夹，以颈总动脉分叉处为标记，推进18 mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。缺血后2 h，拔出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。
2.2.2 脑梗塞率和含水量测定神经功能评分：MCAO/R后第2天、第4天及末次给药后30 min，按Bederson等[12]的方法对动物的神经功能缺陷进行分级评分，标准如下：
0分：未观察到神经症状。1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁。2分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低。3分：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈。4分；
软瘫，肢体无自发活动。
上述指标测定后，脱颈椎处死大鼠，取出全脑称重。在视交叉及其前后各2 mm处做冠状切4刀，切成5片后迅速将脑片置于5 mL含有1%TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30 min，在温孵过程中每隔7~8 min翻动1次，温孵30 min后取出脑片，用数码相机拍照，之后用眼科镊分离苍白区（梗塞区）和非苍白区（正常区），计算梗塞百分比如下：
2.3 灵芝子实体醇提物对小鼠出血时间和凝血时间的影响
2.3.1 采用断尾法检测受试药对小鼠出血时间的影响
取健康清洁级ICR小鼠50只，体重18~22 g，按体重随机分为5组，每组10只，分别为灵芝子实体醇提物高剂量组（40 mg/kg）、灵芝子实体醇提物中剂量组（20 mg/kg）和灵芝子实体醇提物低剂量组（10 mg/kg）、阳性对照氯吡格雷组15 mg/kg和空白组（给以等容积的生理盐水）。每天灌胃给药1次，连续给药7 d，给药容积为0.2 mL/10g体重。末次给药后30 min，将其尾部垂直，用毫米尺测量，并在距尾尖5 mm处作标记，然后用手术刀片在鼠尾标记处垂直切断，待血液自行溢出开始计时，每隔30 s用滤纸吸去血滴1次，直至血液自然停止（滤纸吸时无血为止）即为出血时间，记录出血时间。
2.3.2 采用玻片法检测受试药对小鼠凝血时间的影响动物分组、给药剂量及给药方式同出血时间测定试验。末次给药后30 min，以内径为1 mm的玻璃毛细管插入小鼠眼眶内，使血自动流出，弃去第1滴血，再分别滴血于清洁载玻片的两端，血滴直径为5~10 mm，立即开始计时，此后每隔10 s用干燥针头挑动血液1次，至针头能挑起纤维蛋白丝为止，即为凝血时间，用秒表记录凝血时间。将结果进行组间t检验比较[13]。
2.4 统计学方法
数据统计软件为SPSS 22.0，多组间比较方差齐性时采用单因素方差分析进行数据统计，两两比较；
采用ANOVA检验，两组间比较采用t检验，P＜0.05表示有统计学意义。
3.1 灵芝子实体醇提物于MCAO再灌后2 h给药对大鼠脑缺血损伤的保护作用
结果表明，MCAO/R后第2、4、7天时，模型组大鼠均有较高的神经行为学评分，说明模型组的大鼠神经功能缺陷严重。与模型组相比，灵芝子实体醇提物高剂量组（20 mg/kg）和中剂量组（10 mg/kg）均能显著降低脑缺血大鼠的神经功能评分，低剂量组（5 mg/kg）仅在第4天表现出神经功能改善的作用（P＜0.05）；
与空白组相比，模型组大鼠脑梗死面积和脑含水量均显著升高（P＜0.01），与模型组相比，灵芝子实体醇提物3个剂量组均能显著降低脑梗死面积和含水量（P＜0.01，P＜0.05），且整体效果与阳性药氯吡格雷相似。结果见图1、表1和表2。
表1 醇提物于MCAO再灌后2 h给药对大鼠神经行为学的影响（mean±SD，n=6）Table 1 The effects of alcohol extracts on neurobehavioral in rats 2 h after MCAO reperfusion(mean±SD,n=6)
表2 醇提物于MCAO再灌后2 h给药对大鼠脑梗死率及脑含水量的影响（mean±SD，n=6）Table 2 The effect of alcohol extract administration on cerebral infarction rate and cerebral water content in rats 2 h after MCAO reperfusion(mean±SD,n=6)
图1 2 h给药局灶性脑缺血（MCAO）/再灌注大鼠脑TTC染色代表图（n=8）Fig.1 ImagesofTTC stainingin thebrainofratswithfocalcerebral ischemia(MCAO)/reperfusion after 2 h administration(n=8)
3.2 灵芝子实体醇提物对小鼠出血时间和凝血时间的影响
结果表明，灵芝子实体醇提物给药7 d内，小鼠未出异常的行为学变化，和空白组相比。灵芝子实体醇提物仅高剂量组（40 mg/kg）对小鼠出血时间和凝血时间有显著的延长作用（P＜0.05），中剂量组（20 mg/kg）和低剂量组（10 mg/kg）对小鼠出血时间和凝血时间均无延长作用（P＞0.05）；
阳性药氯吡格雷对小鼠出血时间和凝血时间有显著的延长作用（P＜0.01），结果见表3。
表3 醇提物对小鼠出血时间和凝血时间的影响（mean±SD，n=10）Table 3 Effects of alcohol extracts on the bleeding time and coagulation time in mice(mean±SD,n=10)
缺血性脑卒中是脑卒中的一种，又称脑梗死或者中风，其发病率逐年上升，若治疗不及时，一般伴随认知和/或行动障碍等副作用，给患者及其家庭带来巨大影响[14,15]。在所有的卒中病例中，大约87%属于缺血性脑卒中[16]。缺血性脑卒中的治疗目前仍是研究的难点之一。根据缺血性脑卒中的发病部位、病因、诊疗思路及现在研究者的新发现，缺血性脑卒中动物模型分为局灶性缺血性脑卒中和全脑缺血性脑卒中，常用造模方法有线栓法、开颅电凝阻断法、血栓形成法、栓子栓塞阻断法和球囊导管法等，造模使用的动物有大鼠、小鼠、家兔和家犬等[17]。不同动物、不同造模方法的缺血性脑卒中模型有各自的优缺点，选择合适的动物模型对试验研究极其重要。线栓法制作的局灶性脑缺血模型由于与人类脑缺血后的病理改变比较接近，在脑缺血实验中应用较为广泛[18]。本文参考Longa等的方法，采用大鼠MCAO/R损伤模型，具有以下优点：无需开颅，避免外力干扰损伤脑组织、脑缺血再灌注时间易于把握且造模所需脑梗死部位及栓塞的血管明确、重复性好等[19]。
灵芝作为一种药食两用珍贵中药材，在中国已经有2 000多年的食用历史。灵芝针对心脏血管疾病预防及治疗具有很好的功效，而且安全性高，未发现不良反应[20]。文献报道，灵芝通过特定信号分子和途径发挥其生物学作用，通过降低血糖、调节血脂、稳定血压以及保护心肌细胞和大脑细胞等多条途径和靶点，对心脑血管疾病具有较好的协同治疗作用[21]。灵芝子实体醇提物对灵芝中的灵芝多糖、灵芝三萜和氨基酸等多种功效成分进行了富集[22]，提示我们灵芝醇提物对心脑血管疾病可能具有一定的疗效，值得进一步深入研究。
本文采用对大鼠的神经功能缺陷进行分级评分和检测脑梗塞率和含水量的方法进行模型评价，结果表明，模型组的大鼠神经功能缺陷严重；
模型组大鼠脑梗死面积和脑含水量均显著升高，说明脑缺血再灌注模型建立成功。
灵芝子实体醇提物在MCAO/R后2 h给药能显著降低脑缺血再灌注大鼠的脑梗死面积和脑含水量，并改善行为学变化，并且表现出与阳性药氯吡格雷相似的治疗效果。缺血性脑卒中的药物治疗方案很多，但是目前没有特效药。药物治疗作为保守治疗的一种，是患者比较容易接受的治疗方式，但不同药物产生的疗效和副反应有所不同。灵芝子实体醇提物目前无毒副作用的报道，对该品种的深入研究具有良好的市场前景。
本文同时研究了灵芝子实体醇提物对小鼠出血时间和凝血时间的影响，结果表明灵芝子实体醇提物高剂量组（40 mg/kg）能显著延长小鼠出血时间和凝血时间，且与阳性药氯吡格雷效果类似。以上结果说明灵芝子实体醇提物可有效改善患者血液流变学指标，具有抗凝血的作用，再次提示我们灵芝子实体醇提物或许是对缺血性脑卒中治疗药物的有效补充。
综上所述，应用大鼠局灶性脑缺血（MCAO）再灌注损伤模型对灵芝子实体醇提物的抗缺血性脑卒中药效学的研究，结果表明醇提物在2 h内给药时可以改善脑缺血症状并抗凝血，但其具体的作用机制仍需进一步探讨。
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