郭艳，刘肄辉，李华铭，王宇芳，李春霞
慢性乙型病毒性肝炎（CHB）发病机制复杂，目前尚未完全阐明，乙型肝炎病毒（HBV）引起的免疫反应是肝脏炎症发生的主要机制，与细胞免疫密切相关。近年来，CD4+T辅助性（Th）细胞的几个主要亚群，如Th1、Th2和Th17细胞，已被证明在HBV诱导的肝脏炎症的发展中发挥重要作用[1]。Th9细胞是CD4+T淋巴细胞亚群新成员，研究认为其在CHB中起促炎作用[2]，其在分化与功能上与调节性T淋巴细胞（Treg细胞）具有一定的相关性。目前研究认为，Treg细胞在CHB中主要起免疫抑制作用[3]，而对Th9/Treg在HBV感染中的变化研究较少。本研究旨在观察Th9、Treg及Th9/Treg在不同程度CHB患者中的变化趋势，报道如下。
1.1 一般资料 收集2019年1月至2020年12月浙江省杭州市第三人民医院收治的HBV感染者150例，分为HBV携带组、轻度CHB组、中度CHB组、重度CHB组及乙肝肝硬化组，每组各30例。均符合《慢性乙型肝炎防治指南2019年版》中HBV感染诊断标准[4]。CHB分级标准参考《病毒性肝炎防治方案2000版》[5]：轻度CHB，丙氨酸氨基转移酶（ALT）≤3 ULN，总胆红素（TBiL）≤2 ULN；
中度CHB，ALT＞3 ULN，5 ULN＞TBiL＞2 ULN；
重度CHB，ALT＞3 ULN，TBiL＞5 ULN；
乙肝肝硬化，Child-Pugh分级≥5分，诊断为肝硬化。排除甲型肝炎病毒（HAV）、丙型肝炎病毒（HCV）及戊型肝炎病毒（HEV）等感染，排除合并脂肪性、酒精性和遗传代谢性肝病、失代偿性慢性肝病以及自身免疫相关的其他疾病，排除心脑血管、肝、肾和造血系统重大疾病及精神病患者，排除妊娠或哺乳期妇女。所有患者未接受过抗病毒治疗或免疫调节治疗。
同时选择健康志愿者20名作为对照组。本研究经杭州市第三人民医院医学伦理委员会批准同意，所有患者均签署知情同意书。
1.2 方法 记录患者及健康志愿者的性别及年龄，完成HBV血清学标志物、血清肝功能、HBV-DNA、外周血Th9及Treg等指标检测。
HBV血清标志物采用化学发光法定量检测（美国雅培I-2000全自动免疫发光分析仪），ALT采用全自动生物化学分析仪检测（日本日立全自动7180生化仪），HBV-DNA采用实时荧光定量PCR检测（美国ABI公司ABI7000型全自动荧光定量PCR系统）。TBiL参考范围0～21mol/L，ALT参考范围0～50 U/L，HBV-DNA最低检测下限为＜30 IU/ml。
流式细胞仪购自美国Thermo Attune，Anti-Human CD3及FITC购自MultiSciences，Anti-Human CD8及PE-Cy7购自MultiSciences，IL-9 Monoclonal Antibody(MH9D1)及PerCP-eFluor 710购自eBioscience，Human Regulatory T CellStaining Kit购自MultiSciences，PMA/Ionomycin mixture（250X）佛波酯/离子霉素混合物购自MultiSciences，BFA/Monensin Mixture（250X）布雷非德菌素A/莫能霉素混合物购自MultiSciences，Fix&Perm Kit固定破膜剂购自MultiSciences。检测方法及步骤均按常规流程进行。
1.3 统计方法 数据采用SPSS 26.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用检验，多重比较采用LSD-检验；
计数资料采用2检验；
相关性分析采用Spearman等级相关分析＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 HBV感染组与对照组指标比较 两组性别比、年龄及Th9/Treg值差异均无统计学意义（均P＞0.05），TBiL、ALT、Th9及Treg水平差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。
表1 HBV感染组与对照组指标比较
2.2 不同程度CHB患者Th9及Treg细胞水平变化5组性别比、年龄及HBV-DNA差异均无统计学意义（均P＞0.05），TBiL、ALT、Th9、Treg及Th9/Treg差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。
表2 不同程度CHB患者中Th9及Treg细胞水平变化
2.3 Th9及Treg水平与TBiL、ALT及HBV-DNA的相关性 Th9与Treg呈负相关（r=-0.485，P=0.000）；
Th9细胞与ALT呈正相关（r=0.364，P=0.000），与TBIL呈正相关（r=0.407，P=0.000），与HBV-DNA呈负相关（r=-0.076，P=0.353）；
Treg细胞与ALT呈负相关（r=-0.188，P=0.02），与TBIL呈负相关（r=-0.146，P=0.075），与HBV-DNA呈负相关（r=-0.035，P=0.667）。
先天免疫细胞和适应性免疫细胞在控制HBV感染中发挥关键作用，但它们也可引起炎症，并随后导致肝脏病理。在HBV感染的初始阶段，先天免疫被触发，导致抗病毒细胞因子的产生，随后适应性免疫系统被激活并在肝内招募，从而成功清除病毒，若免疫系统未能清除病毒则转为HBV感染。HBV感染的发病机制较为复杂，迄今尚未完全阐明，HBV不直接杀伤肝细胞，病毒引起的免疫反应是一把双刃剑，它通过破坏病毒感染细胞来抵抗感染，同时引起肝脏炎症，加重肝脏损伤，是导致肝细胞损伤及炎症坏死的主要机制[6]，HBV特异性（适应性）免疫应答在清除HBV中起主要作用。越来越多的证据表明，CD4+T细胞亚群在肝脏炎症的发生发展中起着重要作用，CD4+T细胞反应不足可导致持续性HBV感染及慢性炎症，CD4+T细胞包括Th1、Th2、Th17、Th9及Treg等。
Th9是以分泌IL-9为特征的CD4+T细胞亚群，诸多研究认为其参与了CHB的发病机制[2]。魏金刚等[7]认为HBV感染者外周血Th9较健康对照组明显升高，Th9细胞与HBV持续性感染及高复制状态有关。本研究发现外周血Th9在HBV感染者中较健康对照组明显升高，与笔者前期研究及多数研究一致[2，7-8]，但Cui等[9]的研究认为HBV感染患者外周血Th9细胞频率明显降低，Yu等[10]研究发现CHB外周血Th9细胞与健康对照组差异无统计学意义。出现这种差异的原因可能与入组病例不同及样本数量有关。进一步的研究发现，随着CHB损伤程度的加重，Th9细胞频率逐步升高，5组差异有统计学意义（均P＜0.05）；
相关性分析Th9与TBIL、ALT均呈正相关，提示Th9可能起促炎作用，其与HBV-DNA载量呈负相关，但差异无统计学意义（P＞0.05），Cui等的研究也认为Th9细胞与HBVDNA载量呈负相关，这说明Th9细胞促炎作用的双重反应，即炎症反应同时也促进了病毒的清除。
而另一类CD4+T细胞亚群Treg细胞被认为通过抑制各种类型的细胞，包括树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）、CD4+T和CD8+T细胞，在免疫耐受的发展和维持中发挥关键作用[11]。在急性HBV感染期间，Treg保护肝脏免受免疫介导的肝损伤，而在慢性HBV感染中，Treg参与了肝硬化的发展以及进一步向肝癌的转化和转移，提示Treg在不同疾病阶段发挥不同的作用[12]。本研究发现，慢性HBV感染者外周血Treg较健康对照组明显升高，与其他研究一致[13-14]。与Th9不同，随着肝损伤程度的加重，Treg逐渐降低，5组差异有统计学意义（均P＜0.05）；
相关性分析提示，Treg与ALT呈负相关，Tre g可能通过抑制Th9细胞起抗炎作用。本研究结果Treg与HBV-DNA无明显相关性，但詹爱琴等[13]研究认为Treg水平与HBV-DNA载量呈正相关。
有诸多研究认为，Th17/Treg平衡失衡是导致CHB患者持续病毒感染的重要机制[15]。本研究结果提示，慢性HBV感染者Th9/Treg与对照组差异无统计学意义，与笔者前期研究不一致[8]，可能与入组样本不同有关。进一步的研究发现，Th9/Treg随着肝脏损伤程度的增加而升高，与CHB损伤程度有关，Th9及Treg两者之间可能存在动态变化，从而出现肝脏的免疫耐受或免疫激活，是否影响预后尚需进一步研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 郭艳、刘肄辉：实验操作、论文撰写；
王宇芳、李春霞：数据整理、统计学分析；
李华铭：研究指导、论文修改、经费支持