张 帅, 李超侠, 康 颖, 苏宏华, 周福才, 景田兴, 杨益众
(扬州大学植物保护学院, 扬州 225009)
昆虫经过漫长的进化,为应对环境的变化,在种之下产生了多型现象。一部分为发生在转录调控阶段的非可遗传的多型,比如飞蝗Locustamigratoria的群居型与散居型,棉蚜Aphisgossypii的黄色型和绿色型,褐飞虱Nilaparvatalugens的长翅型和短翅型[1]。另一部分为发生在染色体水平、可以遗传的多型,比如草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda的玉米型和水稻型[2],豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的绿色型和橘色型[3],棉蚜的黄瓜型和棉花型[4]。本文讨论的多型为发生在染色体水平、可遗传的昆虫多型现象。
昆虫的分型是比较宽泛的内容,也是一个不断更新的内容,具有不确定性且分型方法多样。以往昆虫学中的分型直接按表型进行,比如按照取食寄主可以分成不同的寄主偏好型,甚至寄主专化型[4];按照地理区域分布分为不同的地理种群;按照个体某些表型分为不同的类型[1]。随着分子生物学研究的深入,利用分子标记进行昆虫分型的技术不断发展。起初是在蛋白水平,如同工酶技术应用于中华按蚊Anophelessinensis种下分型[5],后来的发展主要集中于核苷酸水平的分型技术。目前在昆虫上用的分子标记类型包括随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)标记、线粒体基因、SSR(simple sequence repeat)标记和SNP(single nucleotide polymorphisms)标记。
当前昆虫分型具有比较强的目的性,并未在昆虫学研究中普遍开展并建立统一的分型标准,仅在数种比较重要的昆虫研究中得到应用。如烟粉虱Bemisiatabaci各型(隐种)间在地理分布[6]、温度耐受[7]、传毒能力[8]、抗药性[9]、种群交配竞争[10]等方面存在明显差异,极大地促进了烟粉虱防治技术发展。
棉蚜是半翅目昆虫,广泛分布于世界各国。棉蚜寄主范围较广,据记载全世界棉蚜的寄主植物有76科600种[11]。生物测定结果表明蚜虫种群在不同的寄主间出现明显的分化,包括木槿型、木豆型、菊花型、黄瓜型、芋头型、茄子型、棉花型和马铃薯型[12-15]。随着分子生物学技术的应用,棉蚜的分型进入一个新的阶段。利用微卫星标记,Vanlerberghe-Masutti等[16]将21个棉蚜群体分为16个基因型,Carletto等[17]将棉蚜按照寄主适合度分为5种寄主类型。在棉蚜线粒体基因组序列的基础上,Zhang等[4,18]分析了采自于我国华北地区不同时期9种寄主上1 046个棉蚜,结果发现它们由57个单倍型构成,其中有3种主要的单倍型,分别为Hap1(棉花上主要类型,属于棉花型棉蚜),Hap3(黄瓜上主要类型,属于黄瓜型棉蚜)和Hap4(棉花上次要类型,属于棉花型棉蚜),三者占总数的86%。
在棉蚜防治过程中,其抗药性是一个突出的问题,棉蚜先后对有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、新烟碱类农药产生抗性,而且抗性上升迅速[19]。1997年-1998年澳大利亚棉田的棉蚜对抗蚜威(>1 700倍)和氧化乐果(>56倍)产生较强的抗性[20]。2008年-2011年对美国田间棉蚜农药抗性系统监测结果表明,棉蚜对噻虫嗪具有高水平的抗性,48 h时抗性倍数可达562倍[21]。2004年-2008年,我国室内棉蚜抗性品系对抗蚜威的抗性倍数从227倍上升到48 000倍[19]。棉蚜的抗药性机制研究报道比较多,主要包括乙酰胆碱酯酶、细胞色素P450、钠离子通道介导和烟碱乙酰胆碱受体介导等主要的抗性机制[19]。目前,P450在棉蚜不同生物型之间的分化情况尚不清楚。本文依据最新发布的棉蚜两种单倍型的基因组数据[22],分析了已报道的与抗性相关的棉蚜P450基因在染色体分布、基因编码、基因结构等方面的异同,探讨棉蚜相关研究中考虑生物型的重要性。
1.1 棉蚜P450的筛选
首先检索Web of Science 数据库中收录的棉蚜P450的文献。在文献中提取关于棉蚜寄主、P450功能以及对应基因的数据库登录信息。在NCBI数据库下载相关序列,并对基因序列进行比对分析,合并重复序列,得到已进行功能研究的棉蚜P450。
1.2 序列生物信息分析
构建单倍型Hap1和Hap3型棉蚜基因组本地数据库,通过BLAST工具(BLAST+ 2.12.0)检索文献获得的P450与基因组中对应区域的信息,将获得的P450与2种单倍型棉蚜基因组数据建立对应关系。
根据BLAST结果，将棉蚜基因组数据中与文献对应的P450基因提取出,分析基因的串联重复情况。根据基因组.gff3文件确定目标基因在染色体上的分布和外显子、内含子情况。使用MEGA 6.0 软件,对来自于文献的P450以及来自于基因组中的基因CDS区(coding sequence)序列和编码的氨基酸序列进行比对,确定序列中的缺失、插入和取代等变异情况。WebLogo 3(http:∥weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)软件用来构建序列标识图(sequence logo)。
根据棉蚜基因组数据(NCBI登录号JAGTJE01和JAGTJF01),提取出P450基因序列,基因簇区域选择该区域所有P450。使用在线版MAFFT version 7软件(https:∥mafft.cbrc.jp/alignment/software/),参数选择默认值,比对基因所在区域基因组序列在Hap1和Hap3型棉蚜中的缺失、插入、取代、复制和倒置等变异信息。使用CENSOR软件工具(https:∥www.girinst.org/censor/index.php),选择“昆虫insects数据库”,鉴定序列中转座子类型。根据基因序列信息及转座子信息,使用IBS在线工具(http:∥ibs.biocuckoo.org/online.php),绘制可视化的基因组结构图谱。
2.1 已确定功能的棉蚜P450基因
通过文献[23,36]数据检索,获得了20个分别能提高棉蚜对棉酚、单宁酸和2-十三烷酮等3种植物次生物质和7种化学农药的耐受性的P450基因(表1)。文献中所使用的棉蚜,有8个种群来自于棉田或用棉花叶片饲养,3个种群来自于黄瓜田或用黄瓜叶片饲养,1个采自于青椒并用黄瓜叶片饲养。
表1 从文献中获得的棉蚜P450及其相关信息
使用文献中给出的基因序列编号,在NCBI中检索到相关的基因序列。对序列整理,合并或删除重复序列,获得17个单一的棉蚜P450基因序列。这些序列分别属于3个P450族(Clan),其中12个属于CYP3族,4个属于CYP2族,1个属于CYP4族(表2)。
2.2 棉蚜P450在基因组上的分布
获得的P450基因序列都能够在Hap1和Hap3型棉蚜基因组数据中找到相应序列。在Hap1型棉蚜中,17个P450基因全部定位在常染色体上,其中12个位于常染色体A1上,2个位于常染色体A2上,3个位于常染色体A3上。在Hap3型棉蚜中,有14个P450基因位于常染色体上,且基因在染色体上的位置与Hap1型棉蚜相同;而CYP6CY13和CYP6DA2(串联基因)位于性染色体X上,不同于Hap1型棉蚜(常染色体A3);CYP6CY7基因未能组装到染色体上(表2)。
2.3 棉蚜P450基因序列差异
在17个棉蚜P450基因中,有8个与Hap1型棉蚜基因组CDS区序列完全相同,与Hap1型棉蚜基因组序列差异最大的是CYP380C6(GenBank编号:MF471383)基因,一致性为97%;有5个与Hap3型棉蚜基因组CDS区序列完全相同,与Hap3型棉蚜基因组序列差异最大的是CYP380C6(GenBank编号:MF471383)基因,一致性为97%。这17个P450基因序列与采集棉蚜的寄主有关,即来源于棉花的棉蚜的P450与Hap1型棉蚜(棉花上主要类型,属于棉花型棉蚜)基因组序列的相似度高,来源于黄瓜的棉蚜的P450与Hap3型棉蚜(黄瓜上主要类型,属于黄瓜型棉蚜)基因组序列的相似度高(表2)。
17个P450基因外显子数量在Hap1和Hap3型棉蚜基因组之间不存在差异,但基因之间的外显子数量存在明显差异,外显子数量在3～13之间。按P450族来分析,12个CYP3族基因的外显子数量在3～6个之间,4个CYP2族基因之中有3个外显子数量大于10个,1个CYP4族基因外显子数量为8个(表2)。
在基因组层面,编码P450基因的序列长度从1 805 bp到59 081 bp不等。仅有编码CYP6DC1基因的序列长度在Hap1和Hap3型棉蚜中相同,8个P450基因在Hap1型棉蚜基因组中序列长度大于Hap3型棉蚜,8个P450基因在Hap3型棉蚜基因组中序列长度大于Hap1型棉蚜,编码CYP6UN1基因的序列长度在两型棉蚜中相差最多,达1 802 bp(表2)。
2.4 棉蚜P450基因存在串联复制分布现象
17个P450基因中有10个位于染色体P450聚集分布区,这10个基因中有8个为两两相邻分布于染色体上,分别由一个寄主为棉花和一个寄主为黄瓜的P450基因构成。成对串联基因[CYP6CY19和CYP6CY13(c21368),CYP6CY4和CYP6CY14]所在区域序列在Hap1和Hap3型棉蚜基因组间保守性较高。序列线性比对结果显示有的序列中存在较多重复片段,结合序列比对发现部分区域有80%的相似性(图1a,b),文献资料表明它们行使不同的解毒功能,功能出现分化(表1)。
图1 棉蚜P450基因对应基因组序列的比对分析
棉蚜P450基因分布区存在大量重复序列。在串联重复基因中,有一对基因(CYP6CY13和CYP6DA2)在Hap1和Hap3型棉蚜中分别位于A3和X染色体之上(表2),进一步分析发现,在组装的Hap3型棉蚜基因组数据中,该段序列一端为高度重复的区域,且染色体组装序列中有缺失序列(gap)存在,所以,这对基因处于Hap1和Hap3型棉蚜不同染色体的结果可能是由染色体的错误组装造成的(图1c,d)。
2.5 多个P450基因串联重复区结构分析
在获得的17个P450基因中,有2个基因在不同文献中同时命名为CYP380C6[27,34],都来自于棉花上的棉蚜,分别在棉蚜耐受螺虫乙酯和溴氰虫酰胺的过程中起作用。二者序列相似性为93%,分别比对到Hap1或Hap3型棉蚜基因组中同一个基因上,相似性分别为99%和97%。此基因位于P450基因簇区域,由5个串联拷贝构成,各个拷贝之间的相似性在79%～100%(图2a,c)。Hap1和Hap3型棉蚜基因组序列中的这段P450基因簇区域存在一段长6 638 bp的差异片段(图2b)。与Repbase数据库比对表明,差异片段包含一个长末端重复序列(long term relationship,LTR)家族的BEL1(between env and LTR)转座子。该区域在各类蚜虫中都存在重复拷贝现象,但不同种的P450基因的拷贝数间存在变异,豌豆蚜中有4个拷贝,桃蚜中有10个拷贝。而且P450基因发生倒位的现象比较普遍。除基因拷贝数存在差异外,该区域的转座子也存在明显变异(图3)。
图2 棉蚜中CYP380C6所在的P450串联重复区序列分析
图3 蚜虫中多个P450基因串联重复区序列结构分析
昆虫种之下的分化在昆虫学研究中越来越受到重视,这些分化不但涉及寄主的利用,还包括环境耐受能力、迁移能力、传毒能力及对农药的耐受性等与农业生产密切相关的特性。种之下的分化往往通过食性等表观的生物学特性进行区分,这种区分具有过程复杂和结果不稳定的特点,通过分子生物学技术能够建立快速、可靠的生物型鉴定体系。昆虫生物型的分子鉴定体系常采用线粒体基因组序列和核基因序列,往往需要利用多个分子标记位点,并结合生物学表型来建立昆虫的生物型鉴定体系。目前,昆虫的生物型往往是按照研究目的进行人为的划分,缺少统一的标准。比如,对于蚜虫的生物型,有按照寄主利用范围进行划分,有按照某种寄主的抗性基因类型进行划分,划分时选择的分子标记基因不同。根据麦双尾蚜Diuraphisnoxia对不同小麦抗性品系的适应能力,将其分为11个生物型。根据大豆蚜Aphisglycines突破大豆抗蚜基因的能力区分不同的生物型[37]。根据棉蚜的微卫星序列将棉蚜分为不同的生物型,它们对不同葫芦科植物适应能力和传播病毒的能力存在差异[38]。
可以看出,蚜虫不同生物型之间存在表型上的差异,这种差异大多数是基因组层面变异的反应。在桃蚜Myzuspersicae两个生物型基因组间,有大约 30%的直系同源基因为生物型特异性缺失/重排[39]。对超过110个桃蚜品系基因组重测序结果表明,在基因组上平均9 bp序列存在一个变异位点[40]。全基因组SNP分析表明,在86个禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi英国种群中,鉴定出4 802个SNP位点,南北种群出现明显的遗传分化[41]。大豆蚜的全基因组测序也显示生物型间存在明显的遗传变异,各生物型间的SNP位点数量为167 249～217 750个,各生物型间含有比较显著的氨基酸突变基因在283～939个[42]。
棉蚜也称瓜蚜,是棉花和瓜类上的重要害虫。由于棉蚜对农药的抗性问题突出,所以也是生产上难以控制的害虫之一,是重点研究的害虫。虽然很早就发现棉蚜种群对寄主的利用能力存在分化,也通过生物测定和分子生物学技术将棉蚜划分为多个生物型,但生物型的研究仅停留在寄主利用方面,在农药抗性机制研究中很少考虑其生物型分化的问题。在昆虫中,多拷贝旁系同源基因多属于CYP3和CYP4族,并经常在染色体上成簇排列,大部分参与次生物质代谢和杀虫剂抗性的P450基因属于这类基因[43]。P450是棉蚜抗药性研究中的主要靶标之一,在已报道的具有次生物质代谢或杀虫剂抗性的17个基因中,有12个属于CYP3族,有10个基因在染色体上处于P450成簇分布区。
由于蚜虫为全着丝粒染色体,其基因组的变异是很常见现象,如蚜虫基因组重排往往导致群体间对杀虫剂的代谢反应出现差异[44]。比对P450基因在Hap1和Hap3型棉蚜基因组上的分布及结构发现,无论是序列的长度、碱基位点还是所处区域的基因构成都存在变异情况。一个比较明显的现象就是尽管串联重复的P450基因间相似性很高,但它们的功能出现分化,在以棉花和黄瓜为寄主的棉蚜中起解毒代谢作用的基因单元不同[26, 32]。P450基因在不同生物型棉蚜间的分化提示我们在研究其功能时,需要针对不同生物型棉蚜进行区别研究,有利于揭示棉蚜抗性发展的分子机制。
棉蚜是种内分化程度较高的昆虫,出现了多种生物型。通过分析棉蚜重要解毒基因P450在两种生物型棉蚜基因组中的分化情况,发现多个P450基因在Hap1和Hap3型棉蚜基因组水平发生分化。这种分化可能会导致基因的表达调控和生物学功能发生变异,从而使两种棉蚜对农药产生耐受性的过程和机制也出现分化。以上结果提示我们在进行棉蚜抗药性及其他方面的研究过程中,需要考虑到棉蚜生物型的分化,针对不同生物型棉蚜分别开展研究。
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