李伟杰，田野，岂晓鑫，蒋桃珍
(中国兽医药品监察所，北京 100081)
鸡白痢沙门菌(Salmonellapullorum)具有高度适应专一宿主的特点，可引起鸡白痢，雏鸡多呈急性败血症经过，成年鸡多呈慢性或隐性经过，可水平传播，亦可经卵垂直传播，是对鸡群危害最严重的病原细菌之一[1]。世界动物卫生组织将鸡白痢列为通报疫病，我国农业部将其列为二类动物疫病。目前在我国，养鸡业存在多种养殖模式，其饲养环境、生物安全管理水平参差不齐，鸡白痢依然发生和流行[2-3]。疫苗接种被认为是降低鸡群感染和防控疾病的有效措施之一，但目前还没有针对鸡白痢的商品化疫苗[4]，生产中多用抗生素进行预防和治疗，但抗生素的长期使用甚至是不合理使用，已使细菌产生耐药性，导致动物成为耐药菌的重要贮存库[5]。
沙门菌的分型方法包括血清学分型、药物敏感试验、多位点序列分型(MLST)等，这些方法在确定与追踪沙门菌的感染及溯源方面起着重要的作用[6]。血清分型是监测动物中沙门菌存在与流行的有效工具，细菌的耐药特征在流行病学研究中同样有重要意义，多位点序列分型是一种基于细菌看家基因序列的分型方法，在对病原体流行病学溯源与监控中起重要作用。
本文采用沙门属特异性PCR、血清学试验、鸡白痢沙门菌/鸡伤寒沙门菌鉴别PCR、MLST等方法和药敏试验分析扬州江都区鸡白痢沙门菌的流行和耐药情况，为合理用药提供指导，也为鸡白痢的综合防控和净化提供参考。
1.1 菌株
样品为2018至2019年从扬州江都区不同养殖场疑似患鸡白痢的病死鸡体内分离的59株沙门菌，PCR阳性对照菌株鸡白痢沙门菌CVCC 79201和鸡伤寒沙门菌CVCC 3759，药敏试验质控菌株大肠杆菌ATCC 25922和ATCC 35218，均由中国兽医药品监察所收集保存。
1.2 培养基和试剂
胰大豆蛋白胨琼脂(TSA)购自OXOID公司；
沙门菌O多价和单价血清购自丹麦国家血清研究院；
10×ExPCR Buffer、dNTP、ExTaq酶、琼脂糖购自宝生物工程(大连)有限公司；
染料Goldview购自北京赛百盛基因技术有限公司；
革兰阴性需氧菌药敏板购自天津金章科技发展有限公司。
1.3 引物
参考文献[7-8]，针对基因invA(编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白)、glgC(编码葡糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶)和speC(编码鸟氨酸脱羧酶)，由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成引物，具体见表1。沙门菌的MLST分型中7个看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA引物参照http：mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica，具体见表1。
表1 引物信息
1.4 沙门菌属PCR鉴定
选择沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA序列设计的1对引物进行扩增，扩增目的片段大小为284 bp，DNA的提取采用热裂解法.
PCR反应体系(50 μL):10×ExPCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板DNA 2 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，补水至50 μL。
PCR反应条件：
94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；
72 ℃延伸10 min。同时设置阳性对照和空白对照。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。
1.5 血清型鉴定
采用玻片凝集法，将复苏的沙门菌在TSA平板中进行传代，用一次性接种环蘸取适量菌苔与O多价血清充分混匀，来回倾斜晃动载玻片10 s，观察凝集现象，若凝集则说明具有对应的O多价抗原；
挑取单菌落在SWARM琼脂中央点一点，37 ℃正向培养过夜，测定H抗原的操作同O抗原，出现凝集反应即为阳性；
以生理盐水作为阴性对照，检查菌株自身有无自凝现象。最后查阅White-Kauffmann抗原表[9]确定沙门菌的血清型。
1.6 glgC和speC双重PCR
采用glgC和speC双重PCR鉴别鸡白痢沙门菌。DNA的提取采用热裂解法。PCR反应体系(50 μL)：10×ExPCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板DNA 2 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，补水至50 μL。
PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；
72 ℃延伸7 min。同时设置阳性对照和空白对照。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。
1.7 多位点序列分型
DNA的提取采用热裂解法。对沙门菌的7个看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA分别进行PCR扩增。
PCR反应体系(50 μL)：10×ExPCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，补水至50 μL。
PCR反应条件：94 ℃预变性5min；
94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；
72 ℃延伸7 min。看家基因扩增产物由中美泰和生物技术(北京)有限公司完成测序，序列测序结果上传http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica进行分析，基于等位基因位点的组合而获得目标菌株的序列型(sequence type，ST)。利用https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_salmonella_seqdef中的BURST程序进行ST型克隆群(clonal complexes，CC)归类。
1.8 药敏试验
操作方法参照文献[10]，利用微量肉汤稀释法对12种抗菌药物进行耐药性分析。将临床分离的59株鸡白痢沙门菌进行复苏培养，挑取2～3个单菌落置5 mL灭菌生理盐水中，用麦氏比浊仪调整浊度至0.5个麦氏浊度，使含菌量约为1.5×108CFU/mL；
取上述菌液60 μL，加入12 mL的药敏接种培养液中，进行混匀稀释，用八道移液器加入96孔革兰阴性需氧菌药敏板中。每孔100 μL，将板条放入恒温培养箱，37 ℃培养18～20 h。在质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围的前提下，按判断标准判断被检菌株的敏感性并进行耐药性结果分析。
2.1 沙门菌的鉴定
对59株临床分离的沙门菌进行属特异性PCR扩增，均扩增出大小284 bp左右的单一目的条带，与预期的片段大小一致，阳性对照成立，空白对照没有扩增条带，部分临床分离株的电泳结果见图1，表明分离菌株均为沙门菌。
M. DL 2000 DNA Marker; 1～9. 临床分离株；
10.空白对照；
11～12.阳性对照图1 部分沙门菌菌株invA基因扩增产物
2.2 血清型鉴定结果
用玻板凝集试验进行血清型鉴定，59株临床分离菌株与O9和O12因子血清均呈阳性反应，而与H-a、H-d、H-g.m、H-g. p因子血清均呈阴性反应，血清抗原式为(9, 12:-:-)。
2.3 双重PCR鉴别
59株确定为沙门菌菌株经双重PCR后电泳检测，仅扩增出252 bp的片段(speC基因)，根据鸡白痢沙门菌PCR鉴定判定标准，59株为鸡白痢沙门菌。临床分离株部分电泳结果见图2。
M． DL 2000 DNA Marker;1～9. 鸡白痢沙门菌临床分离株；
10.鸡白痢沙门菌CVCC 79201；
11.鸡伤寒沙门菌CVCC 3759；
12.空白对照图2 鸡白痢沙门菌鉴别PCR
2.4 多位点序列分型
利用特异性引物对鸡白痢沙门菌临床分离株的基因组DNA进行PCR扩增和测序，得到7个看家基因的序列后上传沙门菌MLST数据库，共得到10个等位基因，不同的等位基因组合后，共获得4种ST型，即ST 92、ST 2151、ST 3721和ST 3722，其中ST 92为优势基因型，具体见表2。利用BURST程序分析，4个ST型同属于CC 2151。
表2 鸡白痢沙门菌MLST鉴定
2.5 耐药性分析
将59株鸡白痢沙门菌进行了12种抗菌药物的敏感试验，结果显示：鸡白痢沙门菌对磺胺异恶唑(SF)的耐药率最高，对氨苄西林(AMP)、头孢噻呋(CEF)、黏菌(CL)素的耐药性次之，对其他8种抗菌药物无耐药性，具体见表3。6株菌存在多重耐药，其中5株为ST 92，1株为ST 3721。59株菌对12种药物的耐药结果形成4种耐药谱型，分别为SF、AMP-CL、AMP-CEF、AMP-CEF-SF。
表3 鸡白痢沙门菌药敏试验
鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌同属于沙门菌血清D1群，血清抗原式均为(1, 9, 12:-:-)，为同一血清型的不同生物型，因此血清学方法不能区分两者[11]。传统的区别方法是基于生化试验，主要包括葡萄糖(产气)、卫矛醇、麦芽糖、鸟氨酸脱羧酶等[12]，但一些临床分离株具有非典型的生化特性[13]。基于DNA的分子技术有限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)和等位基因特异性PCR方法等[14-17]，这些方法都针对单核苷酸多态性，只有单个核苷酸的变异，常规PCR后需进行后续操作或需要二次PCR。因为这些固有的局限性，在临床诊断方面较为费时费力。随着全基因组测序技术的发展，越来越多的沙门菌全基因组序列完成测序，通过序列比对发现在糖原合成基因位点和鸟氨酸脱羧酶合成基因位点，鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌与其他D群肠道沙门菌之间存在差异，据此设计合成引物可以用来区分两者[8, 18]，本研究利用glgC和speC基因特异性引物能够有效的区分59株临床分离的沙门菌。
沙门菌抗原结构复杂，根据菌体抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H抗原)以及Vi抗原的不同，按照Kauffman-White抗原表，截止到2014年共报道了2 659种血清型[19]。依据7个看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA的多位点序列分型，截止到2021年1月22日，将沙门菌分为8 354个ST型。多位点序列分型作为一种常用的适合流行病学调查研究的方法，比血清分型具有更强的分型能力，可以更确切地进行种群的结构以及生物进化方面的研究。本研究中的59株鸡白痢沙门菌分为4种ST型，经BURST程序分析，构成以ST 2151为中心的克隆群，说明从扬州江都区分离的临床分离株具有很高的亲缘关系。
近年来，随着养禽业向规模化和集约化方向发展，细菌性疾病的混合感染导致细菌的耐药性呈上升趋势；
鸡白痢的发病季节越来越不明显，特别是一些饲料添加剂中盲目使用某些抗菌药物，导致沙门菌的耐药谱有很大的差异[20]。细菌的耐药程度也与养殖场的用药习惯密切相关，用药不当，不仅达不到治疗效果，反而容易引起体内正常菌群失调。在临床用药预防和治疗时，应选择平时少用或没有用过的药物，有条件的应结合药敏试验结果选用敏感药物。在做好药物选择的同时加强饲养管理，采取联合用药，轮换使用不同的抗生素进行定期预防，亦可采用微生态制剂来预防鸡白痢[21]。建议养殖场结合本场的条件采用多种方法进行定期监测，淘汰疑似阳性病鸡，从而做到逐步净化鸡群，达到经济效益的最大化。