张芙蕊，陈璟恒，郭梦雅，张爱馨，李和平
（东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040）
动物的消化道和口腔中栖居着大量微生物，它们参与饲料的分解和转化［1］。口腔微生物包括细菌、真菌、古细菌和病毒等全部微生物总和，具有复杂的微生物群落［2］。动物口腔微生物多样性的研究相对肠道较少。不同动物口腔中稳定的优势菌群不同，如仓鼠（Cricetidae）颊囊以德克斯氏菌属（Derxia）为优势菌群［3］，短尾猴（Macacathibetana）口腔中优势菌群主要为链球菌属（Streptococcus）和奈瑟氏菌属（Neisseria）［4］，犬类（Canis lupus）口腔中卟啉单胞菌属（Porphyromonas）为主要菌群［5］。口腔微生物系统是动物整体微生物系统的组成部分，其中含有致病菌群，可通过协同、颉颃和毒力因子中和作用等方式达到动态平衡或引发特定疾病，口腔微生物菌群间相互作用的稳定机制对维持动物机体健康起到至关重要的作用［6］。保守区域和高可变区域，因此16SrRNA分子是研究微生物群落最佳靶分子，可通过16S rRNA保守区序列设计通用引物进行PCR扩增，利用可变区序列进行细菌种属鉴定分类［7］。目前，16S rRNA基因测序技术在微生物生态学领域应用广泛［8］，是目前研究肠道和口腔菌群的重要方法之一，该方法可以直接和全面地分析细菌的基因序列，对菌种进行精确定量鉴定，是现阶段研究微生物菌种丰度的主要方法之一［9-10］。
在家兔（Oryctolagus cuniculus）口腔中，细菌菌落栖居情况尚不清楚。因此，为了探究其口腔细菌群落结构，本试验利用16S rRNA测序技术，通过分析家兔口腔微生物菌种及丰度，确定家兔口腔内细菌种类和优势种群，旨在为家兔的口腔微生物生理作用提供基础的科学参考。
16S rRNA是原核和真核生物共有序列，具有高
1.1 试验动物
体重3～4 kg的3只成年雄性家兔，2017年11月份购自哈尔滨市实验动物养殖基地。
1.2 主要仪器、用品等
兔子固定器、OC-100 DNA样本采集袋（含口腔拭子，购自BIORISE公司）、唾液DNA收集器、5 mL注射器、SAL 2 000 L唾液样本采集管、Qubit dsDNA BR分析试剂盒、手术刀、液氮及液氮罐、棉花、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠（SDS）、75%乙醇、氯仿、异丙醇、TE缓冲液、TENS缓冲液，以上仪器和用品等来源于东北林业大学野生动物与自然保护地学院营养学实验室和华大基因有限公司实验室。
1.3 试验步骤
1.3.1 口腔液体样本的提取 使用兔子固定器将家兔固定，为其注射1 mL乙酰胆碱。10 min后使用注射器对兔耳缘静脉注射空气处死。处死后解剖家兔口腔，用OC-100DNA样本采集袋（含口腔拭子）插入家兔口腔，并进行擦拭，待口腔拭子沾满口腔内液时迅速将口腔拭子插入装有1 mL唾液保存液的唾液DNA收集器中。
将被家兔口腔内液体浸湿的口腔拭子插入SAL 2 000 L唾液样本采集管中，让拭子充分浸入唾液保存液中，之后立刻放入液氮罐中速冻，并送往生物公司进行16S rRNA测序。
1.3.2 总DNA的提取以及定量混合 与D.Quinque等［11］提取DNA的方法相类似，采用改进的方法提取口腔微生物样本总DNA。将口腔拭子置于TENS缓冲液中，加入20 mg／mL蛋白酶K和10%SDS；
将样本放入水浴锅中53℃水浴过夜保存；
使用氯仿除去蛋白质；
使用异丙醇沉淀提取DNA；
在75%乙醇中洗涤后，将提取的DNA置于TE缓冲液中。用Qubit dsDNA BR分析试剂盒与Qubit荧光计对提取的DNA进行定量混合。
1.3.3 细菌V3～V4区扩增及文库构建 用提取的总DNA作为模板，以341F（5′-ACTCCTAGGGGGAGGCAG-3′）和806R（5′-GGACATCHVGGGTWTTCTAAT-3′）为引物，对细菌的16S rRNA V3～V4区进行PCR扩增。使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，在洗脱缓冲液中洗脱并溶于Elution Buffer，完成建库。使用Agilent 2 100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。合格文库通过Illumina Miseq平台进行2×300 bp的双端测序。
1.3.4 生物信息学分析 1）OTU统计。使用FLASH（v1.2.11）软件［12］对序列进行筛选拼接。使用UPARSE（v7.0.1090）软件［13］将相似度大于97%的序列聚类成OTUs并使用UCHIME（v4.2.40）［14］将嵌合体序列与Gold基因数据库进行比较检测。使用核糖体数据库项目分类器对OTU序列进行分类注释，将最小置信阈值设置为0.6并由 QIIME（v1.8.0）［15］在Greengenes数据库上进行检测。在97%相似度下将样品聚类为用于物种分类的OTU（operational taxonomic units），即可操作分类单元，统计样品在每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。
2）绘制OTU Rank曲线。使用USEARCH global［16］将所有Tags与OTU进行比较，以获得样本的OTU丰度统计表。计算每个OTU在样品中的相对丰度，由高至低按丰度进行排列，使用R（v3.1.1）软件，以OTU的等级作为横坐标、以OTU的相对丰度作为纵坐标绘制OTU Rank曲线，
3）构建Shannon-Wiener曲线。利用样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建香农指数曲线（Shannon-Wiener），当曲线趋向平坦时说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息［17］。
4）物种多样性分析。基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析，Alpha多样性使用MOTHUR（v1.31.2）软件［18］进行估算。根据OTU划分结果将样品分为门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）六个分类水平。
2.1 细菌菌群生物信息分析结果
2.1.1 OTU统计 家兔样品中能和OTU代表序列相对应，并且具有注释结果的序列总数为57 904个，共产生264个OTU。
2.1.2 OTU Rank曲线 OTU Rank曲线从物种丰富程度和物种均匀程度两个方面反映了家兔口腔微生物多样性，可以为兔口腔微生物研究提供依据。家兔口腔菌群OTU丰度等级曲线见图1。
图1 家兔口腔菌群OTU丰度等级曲线Fig.1 Curve of OTU rank cluster of rabbit’s oral bateria
2.1.3 Shannon-Wiener曲线 Shannon-Wiener曲线中OTU数量在500左右时曲线已经趋于平缓，说明该测序深度下的测序结果已足够反映当前样本所包含的微生物多样性。家兔口腔菌群Shannon-Wiener曲线见图2。
图2 家兔口腔菌群Shannon-Wiener曲线Fig.2 The Shannon-Wiener index rarefaction plot of rabbit’s oral bacteria
2.2 家兔口腔优势细菌种群多样性分析
家兔口腔内细菌优势种类及其丰度优势种群见表1。其中变形菌门（Proteobacteria）占所鉴定菌群的74.18%，是最具优势的菌门。纲水平上，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）在所鉴定菌群中占比超过三分之二，为最优势纲。目水平上，巴斯德氏菌目（Pasteurellales）占比为38.34%，为高频菌目，其他菌目比例较低。科水平上，巴斯德氏菌科（Pasteurellacece）占比38.38%，为高频菌科。属水平上，放线杆菌属（Acti-nobacillus）、金氏菌属（Kingella）、里氏杆菌属（Riemerella）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）是现已知分类的最具优势菌属。家兔口腔优势菌种有荚膜放线杆菌（Actinobacillus capsulatus）、小韦荣氏球菌（Veillonella parvula）和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis），其他菌种比例较低，荚膜放线杆菌最多，占比为36.86%。口腔微菌属系统进化树见图3。
图3 家兔口腔菌属系统进化树Fig.3 Genus species phylogeny tree of rabbit’s oral bateria
表1 家兔口腔内细菌优势种类及其丰度Tab.1 The sorts and abundances of rabbit"s oral bacteria
本试验采用二代测序技术，以细菌16S rRNA的V3～V4可变区为模板构建文库，使用Illumina Hiseq测序系统，运用可逆链终止物和合成测序法进行测序。测序公司未保留琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量试验结果、文库质检结果，因此结果中未列出。与一代测序相比，二代测序技术读取的碱基长度比一代测序短，但二代测序技术具有高通量、低成本和低错误率等优点［19］。16S rRNA测序法鉴定细菌种类克服了传统培养方法中的鉴定菌种特定性强、培养耗时长和鉴定率不稳定等局限性［20］。因此，现阶段二代测序技术广泛应用于实际研究中，能够全面准确地反映口腔菌群的结构和丰度。
本试验中，分析了微生物物种丰富度及优势菌种，结果显示家兔口腔微生物Simpson index和Shannon-Weiner index平均值分别为0.18和2.54，共检测出57 904条合格序列，产生264个OUT。说明家兔口腔具有较高的微生物物种多样性水平。因此，研究运用16S rRNA测序法了解家兔口腔微生物多样性具有精准性和可靠性，能够为家兔口腔微生物群落组成和适应性研究提供基础的参考资料。研究表明，犬类口腔微生物中Simpson指数和Shannon指数平均数分别为0.08和3.40［5］；
短尾猴口腔微生物中Simpson指数和Shannon指数平均数分别为0.09和3.61［4］。因此，兔口腔微生物的丰富度低于犬类和灵长类，可能是由于草食动物饲料单一导致微生物菌群丰富度比杂食动物低。
家兔盲肠微生物种群在属水平上主要组成为瘤胃球菌属（Ruminococcus）5.070%、布劳特氏菌属（Blautia）2.532%、拟杆菌属（Bacteroides）2.436%和颤螺旋菌属（Oscillospira）2.345%［21］。本试验检测出属水平上家兔口腔微生物与盲肠微生物共同菌属为拟杆菌属和瘤胃球菌属，在家兔口腔中丰度分别为1.09%和0.80%。家兔属于单胃草食动物，主要食物为植物性饲料，具有营养物质循环消化吸收的食粪特性［22］。因此，可能是食粪特性导致家兔部分肠道微生物在口腔中存留，使家兔口腔含有部分与盲肠相同的微生物种群。
菌群的组成和结构与宿主息息相关。家兔口腔检测出种水平上的优势菌群有荚膜放线杆菌、脆弱拟杆菌和小韦荣氏球菌。脆弱拟杆菌是定殖于哺乳动物肠道内的共生菌，与炎症性肠炎和结（直）肠癌形成密切相关［23］，并且可间接促进多糖代谢［24］，脆弱拟杆菌对于维持家兔正常机能必不可少。小韦荣氏球菌大量存在于动物的自然腔道，如口腔、咽部、消化道等［25-26］，它可以有效地促进乳酸代谢［27］，防止家兔机体乳酸的积累。由此可推断，家兔口腔微生物微生态系统中的微生物对其健康具有一定促进作用，但由于环境和数量的限制，微生物在家兔口腔中的益生和致病作用没有在肠道中发挥明显，并且家兔口腔微生物对食物没有直接的消化作用。
兔是口腔医学模型实验动物之一，常应用于下颌骨愈合及修复的实验研究中［28-29］。吴芳等［30］研究的健康人类口腔菌群优势菌属丰度与本研究中的家兔优势菌属丰度差异显著（P＜0.05）。因此，虽然家兔是下颌骨愈合及修复的实验动物，但是家兔不适用于作为人类口腔微生物疾病的模型动物。
本研究通过16S rRNA基因测序分析法测定了家兔口腔微生物组成结构和优势菌群，初步探讨了家兔口腔微生物对维持机体健康的作用，为研究不同动物口腔微生物结构和家兔口腔生理机制提供理论基础。
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