刘杨，张春玲，肖旭，由春香，王小非
(山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室/国家苹果工程技术研究中心，山东泰安 271018)
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统，因其高效、精确和便捷性，被广泛应用于植物基因组基因编辑。CRISPR/Cas9(CRISPR-associated 9)系统已在多种园艺植物中开展研究，例如柑桔[1]、番茄[2]、黄瓜[3]、苹果[4, 5]、葡萄[5, 6]、猕猴桃[7]和山药[8]等。CRISPR/Cpf1(CRISPR fromPrevotellaandFrancisella1)是CRISPR/Cas9系统的一类衍生体，AsCpf1(Acidaminococcussp. BV3L6)、FnCpf1(Francisellatularensissubsp.novicidainU112)以及LbCpf1((Lachnospiraceae bacterium ND2006)是常用的三种Cpf1蛋白[9-11]。相对于Cas9对5’-NGG-3’ PAM(Protospacer adjacent motif)序列的偏好性，CRISPR/Cpf1倾向于富含T碱基的PAM序列并在PAM序列远端造成双链断裂，形成粘性末端缺口，具有突变效率高、多基因编辑元件构建更简易且脱靶率更低等优势，极大拓展了CRISPR/Cas系统应用范围[12, 13]。CRISPR/Cpf1已在水稻[14]、烟草[15]、柑桔[16]以及杨树[17]等植物中实现基因编辑，但苹果(Malus×domestic)中的成功应用报道较少。
相对于苹果组培苗，转基因愈伤组织更容易获得，是验证基因编辑工具效率以及基因功能的有效工具。实验室前期发现，转录因子MdMYB1(MDP0000259614)基因正调控花青苷合成途径，其突变体使王林愈伤组织花青苷积累受阻[18, 19]。因此，笔者以MdMYB1基因作为靶点，构建双靶点的CRISPR/LbCpf1载体并转入王林愈伤组织，分析基因编辑效率，以期在苹果愈伤组织中建立高效的基因编辑体系，进而为苹果分子育种研究提供参考。
1.1 试验材料
王林苹果(Orin)愈伤由实验室保存，于1.5 mg/L 2,4-D和0.4 mg/L 6-BA的MS固体培养基中培养。25 ℃温室中黑暗条件放置，每15 d继代培养。转基因愈伤在含有30 mg/L潮霉素的继代培养基上每15 d继代培养。
1.2 靶点选择
根据实验室前期MDP0000259614的序列在CRISPR-P 2.0网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)进行查询，选择评分低，即预测脱靶率低，GC含量在40%～60%，长度为22～24 bp，PAM序列为5’-NTTT-3’，位置位于编码序列区的靶点1(Target1)(5’-CCTCTCCATGAATCTCAACGCACT-3’)与靶点2(Target2)(5’-GGGCTGAGGTCTTATCACATTGGT-3’)，序列在基因组位置见图1。
图1 MdMYB1基因的靶点位置示意图
1.3 载体构建
CRISPR/LbCpf1多基因编辑载体由朱健康团队赠送[20]。根据载体图谱，利用SnapGene软件进行载体设计，将包含BsaI酶切位点、靶点序列以及crRNA的基因片段通过设计长片段引物LbTarget1-F/LbTarget2-R进行PCR扩增，将目的大小的单一明亮条带进行胶回收，胶回收具体方法参见DNA胶回收试剂盒(诺唯赞，南京)。将载体与片段进行BsaI(New England Biolabs)双酶切，反应体系为50 μL，包含5 μL的10× NEB Buffer、1 μg DNA以及1 μL的BsaI酶，反应时间为1 h，进行凝胶电泳后回收。最后通过T4连接酶(Takara，大连)将载体与插入片段连接，流程见图2。连接产物转化Trans 5α(全式金，北京)，利用相应引物U6-F/Cpf1-R的PCR反应鉴定出阳性菌落，获得MdMYB1双靶点CRISPR/Cpf1基因编辑载体——MYB1-LbCpf1。
图2 载体构建流程图
表1 所用引物
1.4 王林愈伤侵染
载体转化EHA105农杆菌(全式金，北京)，阳性菌落于50 mg/L卡那霉素与10 mg/L利福平LB培养基中培养至OD600=1.0。5 000 rpm收集菌体并用灭菌ddH2O重悬至OD600=0.8。将15 d长势良好的王林愈伤组织压碎浸泡于上述重悬液中，室温下避光振荡15 min，捞出并于滤纸上吸干悬浮液，铺至无抗生素的愈伤培养基。将24 ℃恒温培养箱中暗培养2 d的愈伤组织取出，均匀平铺于含有30 mg/L潮霉素和250 mg/L头孢霉素的愈伤组织培养基中，恒温箱中暗培养30～45 d，将新生的阳性愈伤组织继代在含抗生素培养基中，待3～4轮后取样提取DNA，利用引物进行鉴定。转基因率(%)=转基因愈伤株系/阳性愈伤株系×100。
1.5 基因编辑事件检测
对Target1与Target2 DNA区域分别设计引物MdMYB1-F/R与MdMYB1-F1/R1。试剂盒(康为世纪，北京)法提取阳性愈伤组织DNA，利用Phanta EVO高保真DNA聚合酶(诺唯赞，南京)对包含相应靶点的DNA序列进行扩增，反应体系为50 μL，包含5× EVO Buffer 10 μL、dNTP Mix 1 μL、10 μM引物各1 μL、愈伤组织DNA 100 ng以及1 μL酶，通过95 ℃ 3 min；
95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，32个循环；
72 ℃ 7 min；
4 ℃保温。对PCR产物进行凝胶电泳观察，回收纯化，连接至克隆载体pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit(全式金，北京)并转化大肠杆菌Trans 5α。每个株系挑选8个阳性菌落，送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，利用SnapGene软件进行序列比对并统计。基因编辑效率(%)= 基因编辑事件发生愈伤株系/总转基因株系×100。
1.6 花青苷积累试验
将15 d生长状态一致的野生型与转基因愈伤组织铺在不含氮的培养基中预培养10 d，移至强光低温培养箱(光子通量密度约为100 μmol/s·m2，温度为19 ℃)中培养，观察着色情况。
2.1 转基因愈伤的获得与鉴定
将图2中载体转入王林苹果愈伤组织中，35 d后筛选培养基中有明显新生的愈伤组织，抗性培养基中继代3次获得阳性株系，其中MYB1-LbCpf1载体共获得10个株系，命名为LbCpf1-T1-T2#1至#10。将继代3次的愈伤组织提取DNA，利用潮霉素标签引物进行PCR检测T-DNA插入情况，结果发现野生型愈伤(WL)中出现假阳性条带。于是利用U6-F/Cpf1-R引物检测，结果如图3所示，虽然WL中有杂带产生，但与阳性对照可显著区分，10个MYB1-LbCpf1阳性愈伤组织中有9个含有T-DNA插入区段，表明MYB1-LbCpf1载体的T-DNA片段成功插入转基因愈伤基因组中。
2.2 基因编辑事件检测
提取转基因愈伤组织DNA，利用Target1和Target2区域对应引物进行扩增，将目的片段连接克隆载体并转化大肠杆菌，每个株系的每个靶点挑取阳性单克隆8个送至测序。测序结果表明，9个转基因植株中共有2个株系发生Target1位置的突变，突变效率为22.2%，共有3个株系发生Target2位置的突变，突变效率为33.3%，由于#3在两靶点均发生突变，因此CRISPR/Cpf1双靶点载体造成的总突变率为44.4%(表2)。在发生基因编辑事件的株系送测的所有克隆中，Target1有4个克隆序列发生突变，占16个克隆的25%；
Target2有16个克隆发生突变，占25个克隆的64%。Target1的4个突变类型中，3/4为小片段缺失型突变，缺失碱基数为1 bp、5 bp和7 bp，发生突变株系为#1与#3，1/4为7 bp的替换型突变，发生株系为#3，其中#3发生突变频率最高。而Target2的16个突变类型中，13/16为2～10 bp的小片段缺失型突变，发生株系为#2、#3与#5；
1/8为20 bp与94 bp的大片段缺失型突变，发生株系为#3与#5；
1/16为2 bp的替换型突变，发生株系为#2。上述Target2所有突变类型中，#2发生频次最高，而#3次之(图4)。以上结果表明，本研究中CRISPR/Cpf1引导的双靶点基因编辑在Target2位置有更高的效率。
图3 阳性愈伤组织获得以及T-DNA插入片段的PCR扩增产物电泳
表2 CRISPR/LbCpf1在王林愈伤中的靶点突变率
2.3 CRISPR/Cpf1引导的基因编辑特征分析
统计Target2发生的所有基因编辑事件，分析所有的突变类型发现，CRISPR/Cpf1在苹果基因组中引导的碱基删除事件中，7 bp的小片段删除为发生频率最高的事件(25%)，8 bp的删除次之(18.8%)，而9 bp与2 bp的删除发生频率相仿(12.5%)，以上高频率的碱基删除事件占比68.8%。较大片段(>20 bp)删除的事件发生频率较低，为6.3%。分析发生突变事件的碱基位置发现，距PAM序列14～22 bp的碱基发生突变频率(6.38%～10.64%)高，发生突变频率(10.64%)最高的位置距离PAM序列17 bp。而PAM序列附近发生突变频率(0.71%)最低(图5)。以上结果说明，本研究中CRISPR/Cpf1系统在苹果基因组中倾向于引导小片段碱基删除，碱基突变位置多于PAM序列远端14～22 bp位置。
图4 CRISPR/LbCpf1在苹果愈伤组织基因组不同靶点位置的编辑事件统计
图5 CRISPR/LbCpf1在苹果愈伤组织中的基因编辑特征分析
2.4 MdMYB1基因编辑愈伤的表型验证
为证实利用CRISPR/Cpf1基因编辑愈伤进行功能研究的可行性，选定生长状态一致的野生型与发生基因编辑事件频率较高(#2、#3和#5)的愈伤组织进行花青苷积累试验。结果表明，经过12 d的不含氮诱导以及低温培养，野生型王林愈伤组织已经有少量着色，但3个基因编辑愈伤都没有着色(图6)。限于王林愈伤组织的遗传型特征，经过12 d加7 d的花青苷诱导处理后没有更多花青苷形成，而基因编辑愈伤花青苷积累量始终没有积累花青苷(图中未展示)。以上结果说明，MdMYB1的CRISPR/Cpf1基因编辑愈伤抑制花青苷积累。
图6 基因编辑愈伤花青苷积累试验
为实现CRISPR/Cas9系统的多基因编辑，多转录单元提供了解决思路，但多个启动子与sgRNA的组合使得载体长度过大且构建过程繁琐[7, 21, 22]。而由于CRISPR/Cpf1所需sgRNA长度较短，且Cpf1蛋白的RNA酶活性可将单个sgRNA从串联的CRISPR RNA中释放，因此CRISPR/Cpf1的多基因编辑体系相对于CRISPR/Cas9系统更高效，组装更简便[15]。本研究所用多基因编辑CRISPR/Cpf1载体构建简易，sgRNA支架仅19 bp，通过串联sgRNA支架与sgRNA即可构建出单转录单元的多基因编辑表达盒，可极大降低苹果中多基因编辑的成本。苹果愈伤组织转化效率较高，获得转基因愈伤周期短，适于对基因编辑载体效率以及基因功能的验证。本研究在较短时间内获得转基因愈伤，转化率约90%，较高的转化率使CRISPR/Cpf1的基因编辑效率(44%)也较高，说明苹果愈伤是验证基因编辑效率的高效工具。基因编辑愈伤表现出MdMYB1突变体的性状，说明利用CRISPR/Cpf1体系对基因进行功能研究是可行的。
在MdMYB1基因的编码区分别设计了两个靶点，两靶点距离较远，设计一对引物无法有效地扩增以检测突变情况。因此不能排除Cpf1蛋白在两靶点上共同发挥功能的情况，测序结果中也发现自靶点1后信号混乱，以及无法读出的情况，或许能说明两靶点间发生大片段删除事件。靶点2相对靶点1有着更高的突变率(33.3% >22.2%)，说明靶点2的sgRNA对于靶标基因有着更高的结合效率，而靶点2中出现较高频率的小片段删除也说明sgRNA的高结合率使Cpf1蛋白在靶点2位置有着更高的切割效率。sgRNA选择影响CRISPR/Cas系统效率[23]。而靶点1 sgRNA 3’端较高的GC含量可能是其相对较低的突变率的原因之一[24]。因此，对于苹果中基因编辑高效的靶点的选择应同时结合软件筛选以及转化愈伤组织验证。统计所有株系的突变类型发现，CRISPR/Cpf1倾向于7～9 bp的小片段删除，且突变位置集中在PAM序列远端的14～22 bp，符合典型的CRISPR/LbCpf1体系的基因编辑特征[9, 25]。发生突变的几个株系中出现了较多类型的突变情况，说明在继代过程中，Cpf1可能持续发挥功能对靶点进行切割。鉴于愈伤组织可能为单细胞或多细胞起源，所以基因编辑愈伤可能为杂合体或纯合体，因此呈现了多种的突变类型。如何获得单细胞起源的纯合体基因编辑愈伤是亟待解决的问题。
基因编辑效率受多种因素影响，包括Cas蛋白、载体递送效率以及基因编辑元件的表达效率[26, 27]。通过优化载体中基因编辑元件的启动子可以提高基因编辑效率[28]，苹果中通过应用MdU3启动子显著提高MdPDS基因的编辑效率[29]。因此，为提高CRISPR/Cpf1载体的效率，可将sgRNA启动子替换为苹果MdU6/MdU3启动子。sgRNAs的GC含量高于50%有相对较高的编辑效率[21]，葡萄中发现GC含量高于60%时显著提高基因编辑效率。通过挑选较高GC含量的sgRNAs也是提高CRISPR/Cpf1载体的举措之一。
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