庞月，郭美玲 ，刘芯睿 ，薛淑霞 ，通信作者，孙金生 ，2
（1. 天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；
2. 天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）
锦鲤（Cyprinus carpiovar.koi）属于鲤形目（Cypriniforms）鲤科（Cyprinidae）鲤鱼属（Cypriuus）[1]，养殖环境改变导致体色突变，经过多年杂交选育形成众多锦鲤品系[2]。锦鲤观赏性强，经济效益可观，市场和文化价值深厚[3]。但细菌性疾病发生，会给锦鲤养殖生产造成较大经济损失[4-5]。
养殖锦鲤常见的细菌性疾病有许多，如细菌性败血症、烂鳃病、肠炎病、赤皮病、竖鳞病，腐皮病等。2013年，韩娜娜等[6]从山东地区患病锦鲤体内分离出摩氏摩根氏菌（Morganella morganii），药敏试验结果表明复达欣、庆大霉素和新霉素等11种药物对其有效抑制；
2015年，周阳等[7]从四川地区患病锦鲤体内分离出假单胞菌（Pseudomonassp.），药敏试验结果显示庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素对其具有一定的抑菌作用；
2015年，陈凯等[8]在江苏地区患病锦鲤体内分离出铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），药敏试验发现头孢曲松、卡那霉素、四环素等35种药物抑菌效果较好；
姜艳丽[9]从东北地区患病锦鲤体内分离出嗜水气单胞菌，检测出其携带气溶素（aer）基因，有致病性，发现其对四环素、洛美沙星、头孢噻肟等药物高度敏感。以上研究结果表明，养殖锦鲤细菌性疾病会因时间和地域不同出现不同的流行病原。即使是同一种病原，因为时间和地域不同，也具有不同的致病特性。例如，2017年，杨昆明等[10]从新疆患病锦鲤体内分离出维氏气单胞菌（Aeromonas veronii），用108CFU/mL浓度的菌液注射健康锦鲤每尾0.5 mL后出现死亡现象，药敏试验发现其对庆大霉素、氧氟沙星、头孢噻肟等药物敏感；
而2022年，张凤贤等[11]从河北患病锦鲤体内分离出的维氏气单胞菌同等浓度注射锦鲤1 mL后未出现死亡情况，药敏试验结果显示其对盐酸多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考敏感。因此，分析阐释不同病原分离株的致病特性是十分重要的。
我们从天津地区养殖患病锦鲤体内分离获得一株优势菌株，在确定该菌株为锦鲤致病病原的基础上，进行了菌株鉴定及致病性分析，旨在阐释锦鲤细菌性致病病原的致病特性，为养殖锦鲤细菌性疾病防治提供理论依据。
1.1 试验材料
患病锦鲤由天津某锦鲤养殖基地提供。患病鱼体消瘦，体表有溃疡灶，鱼鳍基部有出血（图1）。健康锦鲤购自水产市场，平均体重28 g，平均体长15 cm。
图1 患病锦鲤的临床症状
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌分离纯化
无菌操作从患病锦鲤的肝脏分离接种细菌于脑心浸出液（Brain Heart Infusion，BHI）固体培养基（购自英国Oxoid公司）上，于28 ℃恒温箱中倒置18 h，选择优势菌落，再次划线得到纯培养菌株CTJ206，挑取长到适合大小的单菌落到BHI液体培养基中180 r/min培养12 h，加入无菌甘油混匀后，转移到- 80 ℃超低温冰箱备用。
1.2.2 生理生化特性鉴定
将菌株CTJ206接种于BHI平板上。28 ℃培养18 h，观察菌落形态特征。用一次性接种环接种单菌落于弧菌科和肠杆菌科细菌生化鉴定管（购自杭州微生物试剂有限公司）中，28 ℃培养24 h观察结果，依据《常见细菌鉴定手册》[12]进行判定。
1.2.3 16S rDNA、gyrB、rpoD基因克隆及序列分析
细菌基因组DNA用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）提取。引物（表1）均由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。
表1 引物序列信息
PCR反应体系：2×TaqMasterMix酶（购自北京博迈德基因技术有限公司）25 µL，上下游引物各 2 µL，ddH2O 19 µL，模板 2 µL，共 50 µL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 2 min，30 个循环；
72 ℃延伸 10 min。测序结果利用MEGA11软件采用邻接法进行系统进化分析。
1.2.4 毒力基因检测
以菌株CTJ206的基因组DNA为模板，参照NAWAZ等[13]和李淑妃等[14]的方法，分别合成气溶素（aerA）、细胞毒性肠毒素（act）、热稳定性肠毒素（ast）、溶血素（hly A）、鞭毛（fla）、核酶（exu）、丝氨酸蛋白酶（ser）、弹性蛋白酶（ahy B）、酯酶（lip）、Ⅲ型分泌系统（ascV）和胞外酶（gcaT）11种毒力基因引物后进行扩增（引物序列见表1）。PCR反应体系25 µL：DNA 2 µL，上、下游引物各1 µL，2×TaqMasterMix酶 12.5 µL，ddH2O 8.5 µL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 45 s，30 个循环；
72 ℃延伸 7 min。
1.2.5 人工感染试验
健康锦鲤在实验室循环水养殖系统中暂养。将锦鲤随机分为6组，每组10尾。感染试验前每组随机取一尾鱼解剖分菌，未分离出致病菌，证明鱼体健康。其中5组腹腔注射浓度分别为4.7×108、4.7×107、4.7×106、4.7×105、4.7×104CFU/mL的CTJ206菌悬液作为试验组，1组注射灭菌生理盐水，作为对照组。每尾注射剂量为0.2 mL。持续曝气，注射前24 h禁食，每两天更换三分之一的水，每日更换滤棉，观察7 d，并记录锦鲤的发病症状和死亡情况。从人工感染后发病鱼的肝脏、脾脏和肾脏中再次进行分菌并鉴定。根据寇氏法计算菌株CTJ206的半数致死量LD50。
1.2.6 药敏试验
将1.0×108CFU/mL菌液吹匀后吸100 µL进行涂布，选用29种药敏纸片（购自杭州微生物试剂有限公司）进行药敏试验。37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径，取平均值来判定CTJ206菌株的药物敏感性。
1.2.7 病理组织切片观察
采集人工感染濒死锦鲤的肝脏和脾脏组织，用4 %的多聚甲醛溶液固定，制备病理组织切片，观察锦鲤的组织病理学变化。
2.1 致病菌分离纯化
菌株CTJ206在BHI平板上28 ℃恒温培养18 h后，菌落呈圆形，其边缘整齐、直径接近1 mm、光滑、灰白色，较不透明，微隆起，用BHI液体培养基培养后菌悬液呈云雾状，生长迅速。
2.2 生理生化鉴定
参考《常见细菌鉴定手册》[12]，菌株 CTJ206与维氏气单胞菌标准菌株（ATCC35624）的生化试验结果基本一致（表2），初步鉴定为维氏气单胞菌。
表2 分离菌株CTJ206和维氏气单胞菌标准菌株（ATCC35624）的生理生化性状
2.3 16S rDNA、gyrB及rpoD基因序列分析
利用保守基因序列比对方法对菌株 CTJ206进行进一步鉴定。利用16S rDNA通用引物扩增得到1 424 bp的片段，gyrB基因和rpoD基因特异性引物扩增后分别得到815 bp和560 bp的片段。测序比对结果显示，菌株CTJ206的16S rDNA序列与维氏气单胞菌（NR044845.1、NR119045.1和NR112838.1）同源性达到99 %，CTJ206的gyrB基因与维氏气单胞菌（MT371999.1和MW838052.1）同源性达到99 %，CTJ206的rpoD基因与维氏气单胞菌（KT970667.1和 MW122075.1）同源性达到 99 %。MEGA11构建的系统进化树显示菌株CTJ206所在分支与维氏气单胞菌聚为一支（图2）。结合形态学、理化特性、保守基因序列分析，可鉴定其为维氏气单胞菌。
图2 CTJ206的保守基因序列系统进化树
2.4 毒力基因检测
毒力基因检测结果（图 3）显示，11种毒力基因中，有 8种（ahyB、ascV、gcaT、act、lip、exu、aerA、fla）可以从菌株 CTJ206中扩增到单一且与预期片段相符合的条带，而ast、ser和hlyA，未检测到阳性条带。
图3 CTJ206的毒力基因扩增结果
2.5 人工感染试验
人工感染后发病锦鲤临床症状主要表现为鱼体反应较迟钝，胸鳍基部出血，肛门红肿，发病症状与自然发病锦鲤相似。对濒死锦鲤进行分菌处理，所分离菌株鉴定结果为维氏气单胞菌，说明菌株CTJ206具有致病作用，证实其为此次锦鲤发病的致病病原。对照组鱼则未分离出该致病菌。统计得到菌株 CTJ206对锦鲤的半数致死量LD50为 1.77×106CFU/g（表 3）。
表3 分离菌株CTJ206注射感染结果
2.6 药敏试验
29种抗生素药敏结果见表 4。分离菌株CTJ206对阿奇霉素、四环素、多西环素、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等21种抗生素敏感；
对卡那霉素和阿米卡星2种抗生素中度敏感；
对红霉素、万古霉素、链霉素等6种抗生素耐药。
表4 分离菌株CTJ206的药物敏感性
2.7 病理组织切片观察结果
病理组织切片观察结果发现（图4），肝脏组织可见红细胞淤积严重，细胞肿胀、核溶解，细胞坏死，空泡变性；
脾脏可见铁血黄素在组织沉积（由血管反复出血造成）。
图4 锦鲤感染维氏气单胞菌后的病理组织学变化
生理生化特性和分子生物学相结合是细菌鉴定的经典方法[15]，正确率较高，但很难区分同一属的不同种细菌，且试验流程繁琐，耗时较长。研究表明，气单胞菌属的多个菌种都是养殖鱼类的致病病原。鳜鱼（Siniperca chuatsi）[16]、鲤鱼[17]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[18]、团头鲂（Megalobrama amblycephala）[19]等可感染嗜水气单胞菌；
一些研究者发现鲢鱼（Cypriniformes:Cyprinidae）[20]、泥鳅（Misgurnus mizolepis）[21]、斑马鱼（Danio rerio）[22]等可感染温和气单胞菌（Aeromonas sobria）；
鲶鱼（Rhamdia quelen）[23]、鲟鱼（Acipenser sinensis）[24]、南方鲇（Silurus meridionalis）[25]等可感染豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）。这些气单胞菌的表型特征相似，所以很难仅仅通过表型特征鉴定菌株到种。16S rDNA序列分析是分子遗传学中细菌种属鉴定标准方法，但是16S rDNA高度保守，对于同一属内的鉴定结果不准确[26]。相关研究表明，管家基因存在一定的突变率且相对保守，可以很好地区分气单胞菌的不同种，其中最常应用的有促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌 RNA聚合酶 σ70因子基因rpoD[27-29]。在16S rDNA序列比对的基础上，我们引入了管家基因gyrB和rpoD进行序列比对。依据分子生物学和生理生化结果，判定分离菌株CTJ206为维氏气单胞菌。
CHEN等[30]从发病异育银鲫中分离出的维氏气单胞菌携带aerA、alt、gcaT、ser、ahyB和lip6个毒力基因，LI等[31]从患病鲶鱼中分离出的维氏气单胞菌主要携带alt、ast、aerA、lip、flaA和hlyA等毒力基因，CHANDRARATHNA等[32]从患病斑马鱼中分离出的维氏气单胞菌携带aerA、lip、ser、exu和gcaT5种毒力基因，本研究显示，分离菌株CTJ206可以检测到8种毒力基因，为fla、exu、ahyB、aerA、act、lip、ascV和gcaT。综合分析以上研究结果，发现维氏气单胞菌均携带的毒力基因有aerA和lip两种，且不同研究检测的毒力基因类别不完全相同。aerA是一种溶血毒素基因，能提高维氏气单胞菌致病能力[33]，LI等[34]发现春季分离的气单胞菌菌株lip基因的携带率明显高于夏季。这说明维氏气单胞菌不同菌株间可检测出的毒力基因呈现出多态性，也说明毒力基因的分布具有漂变性。
抗生素是防治水产养殖动物疾病的主要手段[35]。通过开展药敏试验，选择对病原菌敏感的非禁用抗生素，是目前水产养殖动物细菌性疾病防治的科学手段，同时水产品食用安全也得到了保障[36]。药敏试验结果显示，菌株CTJ206对庆大霉素、四环素、多西环素、诺氟沙星、环丙沙星等21种抗生素敏感，这与CHEN等[30]和康雪微等[37]研究结果部分一致，可根据这些结果，结合水产养殖用药明白纸，选择相应药物来治疗感染维氏气单胞菌的患病锦鲤。菌株CTJ206对卡那霉素和阿米卡星2种抗生素中度敏感；
对红霉素、链霉素、氨苄西林、阿莫西林、万古霉素和甲硝唑6种药物产生耐药，包含β-内酰胺类、氨基糖苷类和多肽类等药物，这可能是因为灭活酶或钝化酶产生使抗菌药物在作用于菌体之前即被破坏、失效、药物作用靶位改变或是细胞外膜通透性改变等原因[38]。这与王家祯等[39]在黄河鲤鱼源、杨小强[40]在金鱼、蔺凌云等[41]在团头鲂源中分离的维氏气单胞菌耐药情况不尽相同，原因可能是鱼类品种不同、菌的来源及地区用药差异等。该试验结果可为锦鲤感染维氏气单胞菌提供依据，但由于地域和菌株来源不同，治疗时要进行对应菌株测定，有针对性地选择药物以达到国家渔业用药准则的要求[42]。
本研究从患病锦鲤体内分离到1株维氏气单胞菌，该菌株携带多种毒力因子，具有强致病性，通过药敏试验为临床用药提供可选择的药物，为锦鲤细菌性疾病防治提供理论依据和技术支撑。
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