谢秀琴 黄剑坚
遗传多样性，又称为基因多样性，开展遗传多样性的研究对森林可持续管理、保护生物多样性、维护森林生态服务功能有积极的意义[1～2]。遗传多样性赋予树木必要的适应性，使其能够在时间和空间上可变的环境中可持续存在[3]。研究者指出，杂合子频率的增加有利于该物种的管理，维持具有高杂合性水平的繁殖个体的种群有利于种群动态和结构的维持[4]。有研究者建议采取措施促进维护遗传多样性，将其作为生态系统的组成部分[5～7]。而选择性伐木可能导致特定基因和整体遗传多样性的丧失，影响森林稳定性[8]，主要原因为砍伐导致有效种群数量减少，从而导致等位基因的丧失并限制了交配的可能性[5]。可见，遗传多样性的研究对于森林经营和生态恢复至关重要。
红树林泛指在热带与亚热带地区的海岸潮间带滩涂上生长的木本植物群落，其消浪护岸、生物多样性保护等多种生态服务功能是陆地森林所不可取代的[9]。目前，个体层次的红树林遗传多样性研究多从大尺度和中尺度层面开展[10～11]，小尺度的研究较为少见。红海榄Rhizophora stylosa属红树科的红树植物，为常绿灌木或小乔木，支柱根极为发达，通常形成纯林，主要分布于广西、广东和海南等地，是沿海红树林生态恢复的优选树种[12]。本项目拟选择广东湛江红树林国家级自然保护区高桥红树林区中的红海榄作为研究对象，从遗传多样性的重要指标——遗传相似性角度出发，开展红海榄群落样方遗传相似性特征研究，旨在为完善生物多样性保护、维护森林生态服务功能、开展红树林生态恢复等提供新的参考。
高桥红树林区是广东湛江红树林国家级自然保护区的核心区，其位于廉江市高桥镇红树林大道，面积超过1 200 hm2，是我国最大的红树林自然保护区。其中有高等植物19 种，浮游植物97种，底栖硅藻159种，鱼类85种，贝类91种，虾蟹62种，浮游动物27种，鸟类170多种[13]。该红树林小区属于亚热带季风气候，年降水量1 550 mm左右[13]。
2.1 样地调查与植物叶片样品采集
对高桥红树林区20 m×20 m 天然红海榄纯林样地进行植物群落调查。先用GPS 测量样地西南角的地理坐标，再以该点为坐标原点，用钢尺测量每株树木在样地内的坐标（x，y），在样木位置图上标记调查木的编号。然后，对样地内树木进行每木调查，记录树种、树高、胸径、距离等林分因子，起测胸径3 cm。随机采集样方内的每一株红海榄的健康叶片10 片，装进密封袋，做好标记，放进装有冰袋的保温箱，带回放在温度-80℃冰箱保存待测。
群落样方位于凤地村，样方仅有26 株古老的红海榄，平均树高5.12 m，平均地径5.43 cm，平均冠幅7.47 m，处于群落演替的后期。
2.2 测试方法
选取红海榄嫩叶为基因组DNA提取材料，采用经改进的CTAB法[14]提取红海榄基因组DNA，温度-20℃保存备用。提取DNA后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测红海榄基因组DNA质量。
实验采用的均是上海生工公司合成的引物。ISSR（Inter-simple sequence repeat）引物为加拿大哥伦比亚大学所公布的第9套ISSR引物。从70 个ISSR 引物筛选出扩增效果好、条带清晰、具有多态性的引物。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）引物参照LI G[15]已开发的引物序列。引物按照完全随机组合的原则，共组合120对。随机选取4个材料的DNA进行引物筛选，利用3%琼脂糖凝胶电泳进行引物初选，较好的引物组合利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行复选。
本实验采用的均是10 μL的PCR反应体系，其中包括5 μL 2×PCR StarMix、3 μL ddH2O、1 μL红海榄模板DNA和1μL引物。ISSR-PCR扩增条件为94℃预变性5 min；
94℃变性35 s，58℃复性35 s，72℃延伸30 s，35 个循环；
然后72℃延伸10 min；
20℃保存。SRAP-PCR 反应程序为94℃预变性5 min；
94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，共5个循环；
随后94℃变性30 s，49 ℃复性50 s，72℃延伸1 min，共35个循环；
最后72℃延伸7 min；
20 ℃保存。将PCR扩增产物进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后利用银染法显影固定出清晰的条带。
2.3 数据统计分析
根据清晰可重复的原则，按照同一迁移位置的条带的有无，有带的记为“1”，无带的记为“0”，建立二元数据矩阵，输入Excel表格中，利用NTSYS 2.02软件计算遗传相似系数（genetic similarity，GS），遗传距离指数则为D=1-GS。对样方内26 株红海榄单株进行UPGMA聚类分析，然后建立系统发育树。根据UPGMA聚类分析来分析群落样方红海榄的基因流图。
2.4 遗传一致性评价方法
GS<0.20 代表同个树种不同单株间遗传相似度极低，亲缘关系极远； GS最大值和最小值的差值为遗传相似极差（genetic similarity range，简称GSR），GSR 表示遗传相似变动的最大范围。GSR<0.20 代表分子林分整体遗传相似变动度极低； GS的平均值（genetic similarity average，简称GSA）表示分子林分整体遗传相似度，GSA<0.20 代表分子林分遗传相似度极低； 聚集度指标主要采用包括扩散系数C、丛生指数I、Cassie.R.M.指标CA、负二项参数K、平均拥挤度m*、聚块性指数指标m*/，详细计算方法见文献[16]。 将种内个体间有碱基差异的位点定义为多态性位点（polymorphic site），作为种内多态性的标志。从70个ISSR引物中筛选出10个多态性好、条带清晰的引物进行PCR扩增，其中具有多态性的位点有60个（表1，图1），多态性位点百分率为82.2%，平均每个引物产生6个多态性位点。从120对SRAP引物中筛选出14对多态性好、条带清晰的引物组合进行PCR扩增，其中具有多态性的位点有88个（表2，图2），多态位点百分率为79.3%，平均每对引物组合产生6.3个多态性位点。扩增出的片段大小均在1 000 bp以下，个别片段在50 bp以下。 图1 ISSR引物880的PCR扩增 图2 SRAP引物组合M11E10的PCR扩增 表1 ISSR引物序列及多态性位点 表2 SRAP引物组合及多态性位点 利用NTSYS 2.02软件将ISSR和SRAP标记合并的多态信息计算出遗传相似系数，对样方内26株红海榄单株进行遗传相似性分析。由表3可得，供试材料两两间的遗传相似系数范围为0.327～0.741，表明样方内26株红海榄单株之间的亲缘关系为远和较近的分布区间； 表3 红海榄分子林分遗传相似系数 对样方内26 株红海榄单株进行UPGMA聚类分析，得到亲缘关系树状图（图3）。由此可得，在相似系数0.55 的水平下，26 株红海榄单株主要分为3个类群：1）红海榄2、11和12 聚为一个类群，遗传相似极差为0.17，遗传相似变动度极低； 图3 基于ISSR和SRAP的红海榄UPGMA聚类图 在相似系数0.60的水平上可分为8类：红海榄单株2和单株26各单独为一类，1和3为一类，5、9、10与19为一类，6、18、21和22为一类； 相似系数0.55的水平下红海榄类群分布格局有所不同（表4）。结合红海榄遗传相似性特征分析结果可知，聚集程度越强，种群遗传相似度越高，种群遗传相似变动度越低。 表4 相似系数0.55水平不同红海榄类群的分布格局 生物遗传多样性是物种适应复杂的环境变化和长期生存下来的重要遗传基础。目前红树林遗传多样性的研究多从大尺度和中尺度的角度研究不同地理种源的遗传多样性[10，17]。本文从小尺度通过ISSR和SRAP两种标记方法开展红海榄遗传相似性研究，并结合了分布格局开展了不同类群遗传相似性分布规律分析。初步研究结果表明，广东高桥红树林区样方内的红海榄具有较高的多态性位点百分率，遗传多样性较为丰富，红海榄单株之间处于亲缘关系为远和亲缘关系为较近的分布区间，遗传相似度中等，遗传相似变动度中等。高桥红海榄纯林为成熟林，树龄为70～80 年，处于群落演替的中后期，林下更新幼苗较少，红海榄群落样方的平均遗传相似度为0.563，遗传相似度中等，是合理的。 在相似系数0.55的水平下红海榄群落样方类群分为3大类，说明可能有来自其他区域的红海榄种群，样方内的红海榄类群在遗传上有较大差异。在三大红海榄类群的交叉影响下，红海榄群落样方遗传相似度中等，遗传相似变动度中等，结果可信。肖兰[18]和邹祯[19]等开展了红树林小尺度的空间遗传结构研究，结果表明红树林树种秋茄树Kandelia obovata、白骨壤Avicennia marina和红树Rhizophora apiculata等纯林和混交林具有高水平的遗传多样性，纯林并未因为物种单一而出现遗传上的负面效应。本文研究结果与肖兰[18]和邹祯[19]对比，直接验证了即使是红树林纯林也具有较大遗传分化的研究结果，这可能得益于其他区域的红海榄种群的胎生繁殖体漂流到广东高桥红海榄区域，建立了目前3个红海榄类群的纯林群落样方。有研究[20]指出，生境破坏和破碎化提高了亲缘关系相近物种之间的交配，长期发展可能会导致近交衰退，进而降低种群的适合度。由于红树林为陆海潮间带的森林，不同地区种源的胎生繁殖体能通过漂流进行交流和定植[11]，即使是纯林或者小群落，也不一定因生境破坏和破碎化而提高亲缘关系相近物种之间的交配。 与前人的研究对比，本文提出了遗传相似性结合了种群分布格局的研究方法，更深入分析了群落样方内红海榄不同种群遗传相似性与树种分布格局之间的关系。本文研究结果表明，三大种群呈现出聚集程度越强，种群遗传相似度越高，种群遗传相似变动度越低的规律。这是目前大部分红树林遗传多样性研究并未报道的研究结果，该结果可为红树林的经营管理以及生态恢复提供重要的参考。本文只研究了一个20 m×20 m 的高桥红海榄纯林典型样方，可能还存在样本不足的问题。以后的研究将在不同区域、不同红树林树种的不同样带设置3个以上样方，开展不同潮带小尺度红树林遗传多样性的分布规律和影响机制等相关研究。同时，本研究采用ISSR和SRAP两种标记方法开展研究，相对于基因测序技术，ISSR 和SRAP扩增得到的数据非常有限。但是，ISSR和SRAP两种标记方法较为简单，方法更为成熟，不需借助昂贵的仪器设备，普通实验室可以快速以更低的成本初步开展红海榄遗传相似性的研究，验证最初的猜测，得到较为理想的结果，以便开展往后的深入研究。往后的研究需要借助测序技术，完成红海榄全基因组的测序，以及开展重测序，更深入了解中国红海榄的遗传多样性特征。 高桥红海榄分子林分具有较为丰富的遗传多样性，分属于不同的类群，在遗传上有差异性，存在一定的基因交流； 注：图片均为作者自摄自绘
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0.202.5 种群分布格局测度方法
3.1 红海榄多态性位点分析
3.2 红海榄遗传相似性特征分析
平均值为0.563，说明分子林分遗传相似度中等；
差值为0.414，说明分子林分遗传相似变动度中等。红海榄14和红海榄16间的遗传相似系数最大，为0.741，说明两者在样方中亲缘关系最近；
红海榄15和红海榄10间的遗传相似系数最小，为0.327，说明两者间具有较大的遗传分化，在样方中亲缘关系最远。
遗传相似平均值为0.624，遗传相似度高。2）1、3、5、9、10、19、26为一个类群，遗传相似极差为0.183，种群遗传相似变动度极低；
遗传相似平均值为0.589，种群遗传相似度中等。3）其余4、13、14等16株红海榄单株为第三类群，遗传相似变动度极低和遗传相似度高。遗传相似变动度为第三类群>第二类群>第一类群；
遗传相似度为第一类群>第二类群>第三类群。群落样方以第三类群为优势种，占据环境资源更多，第一类群最少，为弱势类群。总体上3个类群之间存在一定的基因交流。
20、24和25为一类，11与12为一类，其余4、13、14等9株为一类。同个样方内的红海榄不同单株分属于不同的类群。3.3 红海榄不同种群遗传相似性分布特征
亲缘关系为远和较近之间，遗传相似度和变动度中等，以第三种群为优势种，第一种群为弱势种群，而一个区域或者同个采样地的同个树种可能存在多个种群。初步证明红海榄种群聚集度与遗传相似度成正比，与种群遗传相似变动度成反比。因此，在当前高桥红海榄林的ISSR/SRAP分子标记方法研究基础上，将采用重测序的方法，在天然林和人工林开展下一步的遗传多样性分析工作，为营造近自然的人工生态林，调整单一种群的红海榄人工林提供有效的理论指导。