彭志锋 张 菡 高如意 朱亚博 董 青 王 军 霍 军 边传周*
(1.河南牧业经济学院动物医药学院，郑州，450046；
2.三门峡天鹅湖国家城市湿地公园，三门峡，472100)
Acinetobacterlwoffii；
Identification；
Drug susceptibility tes洛菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)通常被认为是一种条件性致病菌，普遍存在于土壤、水或干燥的环境中，对免疫力低的动物或人来说是一种潜在的病原，不仅可引起医院内感染，造成败血症、肺炎、脑膜炎、尿道感染、皮肤伤口感染或急性胃肠炎[1-6]，而且近年来感染啮齿动物、禽畜和水生动物的报道增多，如鼠、鸭感染洛菲不动杆菌死亡[7-8]、奶牛生乳中分离出洛菲不动杆菌[9]、兔感染洛菲不动杆菌死亡[10]，以及2016—2017年四川省普遍发生裂腹鱼(Schizothoraxspp.)因感染洛菲不动杆菌造成皮肤溃烂和内脏出血[11]。目前为止，还没有野生动物感染洛菲不动杆菌的报道。2020年8月，三门峡天鹅湖国家湿地公园的野生疣鼻天鹅(Cygnusolor)陆续发病，采食量严重下降，排水样、白色和黄绿色粪便，不愿下水，站立不稳，最终消瘦死亡。笔者从病死疣鼻天鹅脏器(肝脏和心脏)中分离到1株细菌，经染色镜检、MALDI-TOF鉴定和16S rDNA序列分析，确定为洛菲不动杆菌。对该分离菌株进行药物敏感性试验，依据试验结果选用敏感药物治疗，取得较好的效果，野生疣鼻天鹅陆续恢复健康。
1.1 病料和菌株来源
病料为河南省三门峡天鹅湖国家城市湿地公园送检的病死疣鼻天鹅肝脏和心脏。药敏试验质控菌株大肠杆菌ATCC25922购自中国普通微生物菌种保存中心。
1.2 分离纯化及革兰染色
无菌取病死疣鼻天鹅肝脏和心脏，放置在生物安全柜内，用酒精棉球对其表面消毒，然后用无菌接种环接触肝脏和心脏的新鲜切面，将接种环上物质接种于鲜血琼脂平板和LB平板，于恒温培养箱中37 ℃培养12～24 h后，挑取单菌落革兰氏染色和镜检。取单菌落接种于LB液体培养基，于恒温振荡培养箱中37 ℃培养12 h，-80 ℃保存备用。
1.3 MALDI-TOF鉴定
用无菌接种环将纯化后的菌株接种于LB平板，于恒温培养箱中37 ℃培养12 h，取单菌落，通过MALDI-TOF(Bruker MALDI-Biotyper，购自Bruker公司)进行菌种鉴定。
1.4 16S rDNA鉴定1.4.1 基因组DNA的提取
取过夜培养的菌液0.5 mL于无菌EP管中，煮沸10 min；
然后12 000 r/min离心5 min，取上清，-20 ℃保存备用。
1.4.2 PCR扩增及构建系统进化树
用16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，采用50.0 μL PCR扩增反应体系：基因组DNA 1.0 μL；
27F和1492R各1.0 μL；
10×Buffer 5.0 μL；
Taq聚合酶1.0 μL；
dNTP 1.0 μL，无菌ddH2O 40.0 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；
72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司双向测通测序。
用NCBI中的BLAST工具对比分析测得的序列。根据对比结果，选取参考菌株和同科不同属菌株的16S rDNA序列，用MEGA-X软件选择Neighbor-joining法构建系统进化树。
1.5 药物敏感性试验
参照CLSI2020[12]规定的方法，采用K-B法检测分离菌株对阿米卡星、加替沙星、多西环素、恩诺沙星、卡那霉素、新霉素、阿莫西林、环丙沙星、大观霉素、头孢噻肟、多黏菌素B、氨苄西林、林可霉素、庆大霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、头孢克肟和克林霉素18种抗菌药物(购自杭州滨和微生物试剂有限公司)的敏感性，用质控菌株进行质控。
2.1 细菌分离培养
细菌分离菌株在LB平板中生长出乳白色、半透明、表面光滑和边缘整齐的小菌落。革兰氏染色为革兰阴性球杆菌，呈单个、成对或短链排列(图1)。
图1 细菌镜检结果(革兰氏染色，1 000×)Fig.1 Bacterial microscopic examination results (Gram’s stain，1 000×)
2.2 MALDI-TOF鉴定
分离菌株蛋白质谱与Bruker MBT临床菌种主库(DB8468_2969)中的洛菲不动杆菌高度一致。
2.3 16S rDNA鉴定
分离菌株16S rDNA序列PCR产物测序结果为1 458 bp(图2)，经BLAST比对，分离菌株16S rDNA序列与洛菲不动杆菌16S rDNA序列相似度达到99.72%，确认该分离菌株为洛菲不动杆菌，将其命名为HeNSMX-1。系统进化树分析显示：分离菌株HeNSMX-1与洛菲不动杆菌处于同一分支，亲缘关系最近(图3)。
图2 分离菌株16S rDNA扩增产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis results of 16S rDNA amplification of isolated strains 注：M.DL2000 DNA Ladder；
1.分离菌株16S rDNA扩增产物；
2.阴性对照 Note：M，DL2000 DNA Ladder.1，The 16S rDNA amplification product of the isolated strain.2，Negative control
图3 不动杆菌属细菌基于16S rDNA基因的进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Acinetobacter spp.based on 16S rDNA genes
2.4 洛菲不动杆菌分离菌株的药敏试验
洛菲不动杆菌分离菌株对阿米卡星、加替沙星、多西环素、卡那霉素、环丙沙星、头孢噻肟、庆大霉素和氧氟沙星敏感，对克林霉素中度敏感，对阿莫西林、氨苄西林和头孢克肟耐药(表1)。
表1 洛菲不动杆菌分离菌株HeNSMX-1的药物敏感性
据报道，洛菲不动杆菌可造成羊驼(Lamaglama)呼吸系统感染[13]、狗脑部积水[14]、鱼内脏出血[11]和兔内脏出血[10]等。本研究通过细菌形态学、MALDI-TOF鉴定和16S rDNA序列分析，确认从病死野生疣鼻天鹅肝脏中分离得到的唯一菌株为洛菲不动杆菌，首次报道了洛菲不动杆菌感染导致野生疣鼻天鹅死亡。
近年来，不动杆菌属细菌的多重耐药受到越来越多研究人员的关注。本研究中的洛菲不动杆菌对阿莫西林、氨苄西林和头孢克肟耐药，鱼源洛菲不动杆菌也对上述药物表现出耐药性[11]。尽管抗生素治疗是防控野生动物细菌性疾病的重要策略，但随着野生动物病原菌耐药性的增强及体内抗生素的蓄积，洛菲不动杆菌可能会危害环境，造成耐药基因种间或跨种的传播。因此，天鹅源洛菲不动杆菌的感染防控策略研究应该聚焦于抗生素替代方法上，如免疫接种和中药疗法[15]。
鉴于洛菲不动杆菌普遍存在于土壤或水中，且近年来不断有水生动物感染洛菲不动杆菌致病的报道[11，16]，野生疣鼻天鹅可能因接触被洛菲不动杆菌污染的水而感染致病。为避免该病的发生，建议三门峡天鹅湖国家城市湿地公园做好地表水洛菲不动杆菌的监测，改善水卫生状况。严禁周边未经处理的生活用水向地表水中排放，从源头上减少含有洛菲不动杆菌的污染水源。
洛菲不动杆菌被认为是医院临床中的一种条件性致病菌，通常与菌血症、肺炎、脑膜炎、腹膜炎和胃肠炎等有关[1-3，17-18]。尽管目前没有天鹅湖湿地公园员工感染洛菲不动杆菌的报道，但随着生态环境的改善，人们接触野生天鹅的机会增多，应加强对洛菲不动杆菌感染因素的研究，尽量避免该菌在天鹅与人之间传播。
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