杜希宽，李士丛，袁星星，蔡振晔，顾和平，陈 新
（1.江苏省剑丰农业实业有限公司，江苏 大丰 224100；
2.江苏省农业科学院 经济作物研究所，江苏 南京 210014）
土壤盐渍化是一个世界性的环境生态问题和农业资源问题［1］。环境胁迫严重影响着植物的生长发育，造成作物产量的逐年下降，因此对植物在各种胁迫下的耐受力和适应性机制的研究一直是学者们关注的热点［2］。随着科技的迅猛发展，城市化进程的不断加快，人类所拥有的有效耕地面积正在快速减少，尽可能减缓现有土地的盐渍化、加快开发和利用原有的盐碱土［3］、选育耐盐的农作物品种等，是近年来学者们研究的重点课题［4］。
选育耐盐作物品种，可以有效提高部分作物的耐盐性，使一些盐分含量不算高的土壤能够适于作物栽培［5］。通过驯化技术，对部分作物在生长早期进行耐盐性驯化，提高这些作物体内的耐盐基因表达量，也可以提高部分作物的耐盐性［6］。尤其是对需要育苗移栽的作物，可以在育苗阶段对幼苗进行耐盐性驯化，并激活其体内耐盐高表达基因，就有可能将被处理作物的耐盐性提高到一定比例，进而提高部分中度盐碱地的利用率［1］。高盐胁迫下可以通过表型分析初步筛选出耐盐植株，赵成等［7］研究发现，拟南芥At5g66070基因纯合突变体在高盐处理下其萌发率比野生型低，根长比野生型要短，幼苗更易枯萎。郭雁君等［8］研究认为，盐胁迫下砂糖橘株高生长受到的抑制最明显，地径和冠幅生长受到的抑制次之，对植株生物量积累的影响来说，叶生物量受到的影响最明显，比根生物量积累受到的影响要大。
通过检测植物在逆境胁迫下叶绿素荧光参数可以判断植物受胁迫伤害的程度［9］，在水稻的耐盐性试验中发现，最大光能转化效率(Fv/Fm)、最大荧光产量(Fm)、实际光化学量子产量(Y)和非光化学荧光猝灭系数(NPQ)与水稻盐胁迫高度相关，NPQ和Fv/Fm在耐盐品种中具有关键作用［10-11］。同低盐处理相比，高盐胁迫的茅苍术光化学猝灭系数(qP)下降，非光化学荧光猝灭系数升高［12］。在钠盐(150 mmol/L)处理下，小麦的最大光化学效率等叶绿素荧光参数显著下降，并且低盐有效缓解了小麦幼苗的盐害，高盐增强了盐的毒害作用［13］，由此可知，对作物的低胁迫驯化有助于提高作物对非生物胁迫的耐受性，烟草经低温驯化后与非低温驯化的烟草相比，受冷胁迫其叶片Y、NPQ显著降低［14］。
以上研究表明，通过检测叶片的叶绿素荧光参数可以判别作物的生长发育以及应对逆境胁迫等生理响应，例如经过壳聚糖处理后的小麦幼苗的Fv/Fo、qP和荧光衰减率(Rfd)值分别增加了11.0%、18.6%和14.7%，而NPQ明显降低，这可能导致光利用效率的提高和小麦幼苗的显著快速生长［15］。碱胁迫下，番茄SlSAMS1基因的过表达使转基因植株的净光合速率、叶绿素浓度、Fv/Fm和ΦPSⅡ与野生型相比显著升高［16］。在盐、干旱和碱胁迫下大麦幼苗的最大光化学效率和光化学猝灭系数均降低,表明以上胁迫都增加了PSⅡ对光抑制的敏感性，通过降低光化学吸收降低了光合活性，增加了PSⅡ反应中心的活性强度［17］。有研究发现，耐盐大白菜品种在盐胁迫下其PSⅡ最大光化学量子产率和非光化学猝灭均无显著影响［18］，这为进一步研究作物耐盐品种奠定了基础。铜胁迫下矮牵牛花PSⅡ的最大光化学效率、非光化学猝灭系数和光化学猝灭系数显著降低［19］。
本文以辣椒为研究对象，通过对3个盐敏感程度不同的品种进行不同梯度的盐驯化，检测了辣椒的株高、分枝数、开花数和叶绿素荧光参数等指标，旨在筛选出最佳的辣椒盐驯化浓度，以提高辣椒在大田生长环境下的抗盐性。
1.1 试验材料
供试品种分别为安徽萧县阳光椒业技术发展有限公司生产的杂交种天艳008（简称1号品种），安徽六安市农百万种业有限公司生产的杂交种超级薄皮王和薄皮玉尊（分别简称3号品种和5号品种）。试验前，先对购自市场上的20个辣椒品种进行了预备试验，遴选出对盐分具有不同抗性水平的种质。NaCl来自广东汕头市西陇科学股份有限公司生产的氯化钠分析纯，有效成分大于99.5%。
1.2 试验设计
试验于2022年4—9月在江苏南京进行。先将种子进行表面杀菌处理，然后在普通塑料大棚内采用普通育苗基质育苗。育苗前，对基质进行反复搅拌，确保基质内含物充分混合，保证试验过程和方法的一致性。每个品种育苗150株，合计450株，共栽培150盆。每个试验小区选取3株幼苗进行最终数据测量，每个处理重复3次，以减少试验误差。育苗后20 d，苗高15～16 cm，开始进行盐分驯化。先将幼苗从穴盘内取出，将根系携带的基质全部冲洗干净，装入边长为6.5 cm的台形育苗塑料钵，每个营养钵装3株苗，分别置于0、30、60、90和120 mmol/L浓度为0.3%的Hoagland溶液中，进行盐分驯化处理，处理时间为120 h。然后将所有处理的幼苗根系冲洗干净，置于浓度为0.3%的Hoagland溶液中恢复生长72 h。最后移栽到蛭石水培箱中，水培箱的溶液为0、100和200 mmol/L高浓度NaCl溶液和浓度为0.3%的Hoagland溶液的混合液，对驯化后的幼苗进行高盐胁迫处理。
1.3 试验数据采集
驯化结束后，使用FluorCam多光谱荧光成像仪器（产自捷克）对所有被驯化处理的辣椒幼苗进行叶绿素荧光猝灭分析［20］，先将供试植株放置于暗室内30 min，然后进行叶绿素荧光成像和数据分析，最后使用GraphPad Prism 8软件进行数据处理。辣椒幼苗的主要表型数据在高浓度盐胁迫处理结束后立即进行采集。株高测定的是子叶节到顶部生长点之间的长度；
绿色叶片数是指叶片为中等绿色且具有光合能力的叶片的数量；
单株鲜重是指植株的全部鲜重，包括根系和植株冠层；
株宽测定的是当植株处于正常生长状态时，植株冠层最宽处的尺寸；
单株干重测定的是将新鲜植株置于烘箱内，120 ℃烘烤2 h，然后将试验材料在烘箱内自然冷却10 h后称取的重量。
2.1 高盐胁迫下受试辣椒品种的表型特征分析
高浓度盐处理能够显著抑制植株的发育和繁殖，对作物的生长造成不可逆的影响。本研究随机选取1号品种进行高盐诱导试验，在高盐处理后，受试辣椒表型特征的差异及其显著性如表1所示。与对照相比，100 mmol/L NaCl浓度处理下，株高、绿色叶片数、单株鲜重、单株干重等非保守性状分别降低了12.03%、19.26%、17.63%和9.14%，表明该浓度盐处理下明显抑制了辣椒的生长；
200 mmol/L NaCl浓度处理下，株高、绿色叶片数、单株鲜重、单株干重分别降低了28.78%、27.70%、41.73%和28.20%，表明该浓度盐处理下生物量的产生受到了更大的抑制。由表1可知，仅单株分枝数和花蕾数2个表型特征在高盐处理后明显增加，相关研究表明高盐处理能够促进植株的早熟，由此推测高盐处理有可能缩短辣椒的生育期，促进其分枝和花蕾数的增加。从以上分析结果可以得出，高盐处理对辣椒植株的表型特征具有极显著的抑制作用，盐分浓度越高抑制效果越明显，尤其是对其生物量的影响，反映了盐浓度在达到一定阈值后能负调控辣椒的生长。
表1 不同浓度盐胁迫下对辣椒幼苗主要表型特征的影响
2.2 不同驯化强度下辣椒品种主要表型特征的差异性分析
适度的胁迫诱导对植株能够起到驯化的作用，可有效提高植株的胁迫耐受性。本试验对3个辣椒品种进行了盐驯化处理，表2为盐驯化处理条件下3个辣椒品种受高盐胁迫的主要表型特征。由表2可知，辣椒1号品种在NaCl浓度为60 mmol/L时，驯化效果最好，所测定的9种表型性状指标除了单株分支数、主茎节数外，大都极显著地优于其他NaCl处理浓度的；
低于该浓度，可能不能诱导辣椒幼苗耐盐基因的激活，或者难以使辣椒幼苗耐盐基因的表达量获得较大提升；
高于该浓度，可能导致辣椒幼苗伤害过重，不仅在驯化结束期表现不佳，而且在之后的高盐胁迫期，也没有良好地抵御高盐伤害的能力。细胞内Na+/K+平衡对维持植株的生长具有重要作用，本研究认为在60 mmol/L盐处理下辣椒体内Na+/K+平衡维持达到了一个最佳的状态，能够增强辣椒对盐的耐受性，同时减少离子毒害对辣椒育苗造成的伤害。
为研究辣椒品种和盐驯化浓度是否存在某种关联，本研究分析了辣椒3号品种和5号品种与盐驯化浓度之间的互作效应（表2）。从表2可知，3号品种和5号品种在不同盐驯化浓度下，均表现为60 mmol/L NaCl的处理效果最好，进一步说明在这3个辣椒品种之间不存在最佳盐驯化浓度的差异。
表2 不同盐驯化条件下3个辣椒品种受高盐胁迫主要表型特征比较
通过对上述辣椒幼苗进行叶绿素荧光成像分析可知（图1、图2），1、3、5号试验组分别与CK1、CK3、CK5相比，Fv/Fm、Fm、qP、Rfd、NPQ这5个参数值发生了明显变化；
对照中不同品种间Fv/Fm、Fm、Rfd这3个参数无显著差异，而不同品种间的qP、NPQ差异较大，表明qP、NPQ的变化不仅与盐浓度有关，也与辣椒品种有关。通过进一步观察辣椒不同驯化强度下的叶绿素荧光参数发现，1、3、5号试验组在60 mmol/L NaCl胁迫下3个辣椒品种的Fv/Fm、Fm、qP、Rfd参数值都是最高的，NPQ则表现为最低，与其他盐驯化浓度相比具有显著差异，这进一步表明60 mmol/L NaCl浓度是提高辣椒耐盐性最佳的盐驯化浓度。分析原因可能有以下2点：一是参试材料均为辣椒，3个辣椒品种的差异仅仅是品种上的差异，遗传组成差异度较小；
二是作物的耐盐性可能存在某种阈值，只有达到该阈值，耐盐基因才能启动。
2.3 耐盐处理后不同辣椒品种表型性状分析
由表2可知，低盐驯化过的3个辣椒品种，在高盐处理时，除了单株分枝数和主茎节数外，3号品种其余性状大都优于1号和5号品种。初步说明，3号品种相比于1号和5号品种而言耐盐性最好，3号品种对高盐胁迫具有最好的抗性。通过多光谱荧光成像系统对上述高盐胁迫下幼苗进行叶绿素荧光检测，如图1所示，1号、3号、5号植株的5个叶绿素荧光参数分别与CK1、CK3、CK5相比都发生了差异性变化，在200 mmol/L NaCl胁迫下3号品种的Fv/Fm、Fm、qP参数值都是最高的，NPQ最低，且与1号、5号相比差异显著；
从图2也可以看出，3号品种的上述4个叶绿素荧光指数明显优于1号和5号品种。综合以上分析表明，3号品种在高盐胁迫下可以通过提高其最大光合效率、光化学猝灭系数，降低非光化学荧光猝灭系数以提高其耐盐表型。
图1 不同浓度处理下辣椒幼苗在盐驯化后叶绿素荧光参数分析
图2 不同浓度盐处理下辣椒幼苗在盐驯化后叶绿素荧光参数表型成像分析
3.1 沉默基因的激活和表达的条件性探析
2014年由华大基因和墨西哥生物多样性基因组学国家重点实验室等13个单位联合公布了辣椒品种的全基因测序结果，研究表明：辣椒栽培种的染色体数目为2n=2x=24，在24条染色体中，共有69812个基因，这些基因包括功能基因和结构基因［21］。综合多种植物的研究报道可知，大多数植物在正常生长环境下，仅有30%左右的基因在发挥作用，多数基因处于休眠或沉默状态，只有遭遇特殊的环境或理化因素影响，这些基因的功能才能被激活表达，包括各种生物逆境或非生物逆境，而这些基因的表达一般可以是通过转录因子结合相应基因的启动子激活［22］，这可以被认为是对植物进行有效驯化的基因基础，例如小麦可以通过苗期的耐冷驯化提高其生长中后期的耐寒性；
大豆可以通过耐高温处理，有限度地提高大豆的耐热性。在盐胁迫下，一定的盐诱导促进了磷脂酸的积累，激活细胞外信号转导通路及相关耐盐基因的表达，增强细胞内Na+的外排，从而提高植株的耐盐性［23］。据此，本研究认为，通过辣椒苗期的耐盐驯化，可以有限度地提高辣椒的高盐耐受性。沉默基因的激活，需要满足一定的条件，不同植物、同类植物的不同种，所需要的激活剂量会有很大差异，这就要根据实际需求进行定量研究，继而找出符合实际要求的激活剂量和方法。对于盐处理下辣椒幼苗初期的耐盐性鉴定可以通过叶绿素荧光参数检测判别其耐盐指数，对于寻找合适的盐驯化浓度具有重要作用。逆境胁迫下植株最大光能转化效率、最大荧光产量、光化学猝灭系数、荧光衰减率等荧光参数降低，非光化学荧光猝灭系数升高［10，24，25］，本研究发现在盐胁迫下60 mmol/L NaCl驯化下辣椒植株抗逆能力最好，PSⅡ荧光产量和PSⅡ反应中心的开放程度增强，光保护能力增强。为了更好地检测该强度驯化下辣椒抗逆能力，可以进一步对其生理生化物质，包括活性氧、POD酶含量、叶绿素含量以及盐基因表达量等进行检测，进一步验证上述结果。
3.2 驯化技术是作物遗传改良的有益补充
据统计，到目前为止人类栽培的农作物大约有3000多种，其中大面积栽培的农作物仅有150余种，而这些作物就是当今人类重点进行遗传改良的对象［26］。经过60多年的科学探索，我国创新和积累了作物遗传改良的大量技术和手段，主要包括系统育种、杂交育种、分子标记辅助育种、转基因育种等［27］。驯化作为通过基因突变、基因修复或基因重组引起的新物种的创建技术的补充，在人类活动和经济发展中曾发挥了重要的作用，此外，对拟南芥的研究发现，50 mmol/L NaCl低盐驯化后可使野生拟南芥在200 mmol/L NaCl处理下维持正常，而不经低盐驯化的拟南芥在200 mmol/L NaCl处理下全部白化［28］。结合本研究低盐驯化以提高辣椒耐盐的各项生理指标，因此，本研究认为，在低盐或盐碱化土地种植经过盐驯化后的幼苗可能对辣椒产量的提高具有重要作用。再者，由于驯化相比于遗传改良，后者的基因纯合、优良家系的选择和性状稳定需要花费更多的时间、财力和精力。驯化技术投资少、见效快，容易较快地将阶段性成果转化为社会生产力。需要指出的是，为了达到较好的驯化效果，需要对不同驯化对象的阈值进行科学的研究，既要使得沉默基因能够有效激活，具有较强的基因表达量，并且使得这种表达量在一个生长周期能够稳定地保持。又要防止激活剂量的过大可能带来的基因和器官的重大伤害。长期的连续驯化通过基因表达量的不断积累和获得性遗传，使得被驯化性状可以在遗传上获得稳定性。通过一定浓度的盐驯化可以综合提高植株的胁迫耐受性，前人指出盐胁迫与干旱、冷害和病害存在交叉作用，适度的盐处理可以改变植株对这些胁迫的耐受性［29］。综合以上研究，为了应对现在极端高温和冷害天气的频繁出现对作物产量带来的影响，也可以通过各种低温、适度高温、干旱等提前对作物进行胁迫诱导驯化，可能是一种及时减少作物产量损失的有效方法。
3.3 作物的耐盐性在不同发育阶段的差异性评价
作物的耐盐性研究是人们从事非生物逆境研究的重要题材之一。其目的是通过耐盐性研究了解作物耐盐的生理机制，寻找耐盐基因，培育耐盐品种等，最终提高作物在较高盐土环境下的较高生产力。但是，作物的耐盐性在不同发育阶段具有较大差异，不能将种子萌发期或者苗期作物的耐盐水平推断为该作物整个生命周期的耐性水平。综合现有的研究报道可知， 20年来，公开发表的与作物耐盐性相关的文章大多数是研究萌发期和苗期的耐盐性，实际上，从技术运用的角度来看，更需要研究作物全生育期的耐盐性，尤其是对作物生产力的影响，潘晓飚等［30］关于水稻耐盐性的研究指出，水稻在盆栽条件下各个生育期耐盐性差异较大，发芽期耐盐性大于幼苗期和全生育期，并且各个生育期耐盐性没有显著关系。本研究鉴于上述分析，在低盐情况下寻找合适的辣椒幼苗盐驯化强度，对促进辣椒在盐碱地生长具有重要作用。为了综合评价辣椒的耐盐性，需要对辣椒幼苗和全生育期的耐盐性做进一步的研究，探讨盐驯化后不同生育期辣椒的耐盐性。
综上所述，本研究得出的盐驯化条件能够显著提高3个辣椒品种的耐盐性，60 mmol/L NaCl浓度为最佳盐驯化浓度，在高盐胁迫下3号品种具有最好的耐盐性。
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