赵盈盈，秦晓晓，韩莹琰，郝敬虹，刘超杰，范双喜
(北京农学院 植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京102206)
叶用莴苣富含矿质元素、纤维素和生物活性物质，如叶酸(维生素 B9)、β-胡萝卜素、叶黄素和抗氧化物[1]，已成为最受欢迎的蔬菜之一，可用作沙拉配料或新鲜食用[2]。与绿叶生菜相比，紫叶生菜色泽鲜艳，花青素含量较高，具有抗氧化、抗心血管病、抗癌等保健功能，越来越受到市场青睐[3-5]。
光质对植物的次生代谢物的生物合成和积累影响较大[6]，花色苷作为重要的次生代谢物，对人体具有保健功能。研究发现MYB转录因子参与黄酮类代谢途径，影响植物色素的合成。在MYB家族中，R2R3MYB是最重要也是成员数最多，对黄酮类化合物合成影响最大的亚家族。近年来研究表明R2R3MYB的调控受外界因子，比如光的影响，来参与植物生长发育、代谢过程，响应生物和非生物胁迫，并参与植物激素合成和信号转导[7]。例如，Hartmann[8]等发现CHS存在光响应元件(Light regulatory unit,LRU),同时也在LRU序列中发现了MYB识别元件(MYB recognition element,MRE)，而R2R3MYB转录因子能够与包含MRE元件的结构基因相互作用，这表明R2R3MYB参与了光介导的黄酮类物质的合成，但具体作用尚不明确。调控花色苷合成的MYB转录因子在果树中研究较多,如草莓、苹果、葡萄等[9-11]，但在蔬菜尤其是紫叶生菜中的功能机制仍不清楚。
前期课题组对白光、红光和蓝光处理下的北紫生4号进行转录组测序，筛选出30个差异表达的转录因子。本研究根据转录组测序结果，筛选出在蓝光处理下差异表达基因LsMYB44，克隆其全长，并对其进行生物信息学分析，通过荧光定量PCR，对其表达量进行分析，本研究为进一步解析紫叶生菜在不同光质下黄酮类化合物的合成机制提供参考。
1.1 试验材料与处理
选用自主选育的品种北紫生4号(BZ-4)为试验材料。将种子催芽12 h后播种于穴盘中，放置于人工气候室内，白天温度为22 ℃，晚上温度为17 ℃，设定光强为270 μmol/m2/s,光照时间为14 h/d，相对湿度为70 %，长到3叶1心的时候定植。缓苗后放到HP600GS-3LED三色光植物培养箱中进行光质处理，其中以白光为对照，分别给予红光、蓝光、以及在白光基础上添加红蓝光比例为2∶1、1∶1、1∶2的处理，处理30 d后取样，-80 ℃保存。
1.2 试验方法
1.2.1 样品总RNA提取和反转录 使用北京华越洋生物科技有限公司RNA提取试剂盒提取叶用莴苣总RNA，使用北京全式金生物技术有限公司的TransScript© One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反转录试剂盒合成第一链cDNA。
1.2.2 叶用莴苣LsMYB44基因克隆以及qRT-PCR 以转录组测序中的LsMYB44序列为模板，使用Primer5.0设计qRT-PCR引物和克隆引物，选用叶用莴苣18s作为内参基因(表1)。以叶用莴苣叶片cDNA为模板，对LsMYB44基因进行克隆。反应程序为95 ℃ 3 min；
95 ℃ 15 s；
58 ℃ 15 s；
72 ℃ 24 s;72 ℃ 5 min，共35个循环。PCR产物进行凝胶电泳并用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，连接到北京全式金生物技术有限公司的Peasy©-Blunt Zero Cloning Vector载体上，并将其导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，摇菌液后进行测序。以不同光质处理的叶用莴苣叶片cDNA为模板，在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR。反应体系为20 μL,反应程序为95 ℃ 2 min；
95 ℃ 5 s；
60 ℃ 30 s，共39个循环。采用2-ΔΔCt相对定量方法计算出基因的相对表达量，并用SPSS20进行分析。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences
1.2.3 叶用莴苣LsMYB44序列的生物信息学分析 使用Prot Param分析LsMYB44蛋白质的各项参数；
通过NCBI CD-Search分析LsMYB44蛋白的保守结构域；
使用软件MEGA7构建系统进化树；
运用SignalP 5.0进行信号肽预测；
运用SOPMA对蛋白质的二级结构预测；
SWISS-MODEL预测蛋白质的三维结构；
利用Plant CARE软件对LsMYB44基因启动子序列上的顺式作用元件预测分析。
2.1 叶用莴苣LsMYB44转录因子克隆
利用RT-PCR方法，克隆了北紫生4号中MYB44转录因子的编码区(图1)，特异性扩增片段显示在750～1 000 bp之间，片段大小符合预期，测序结果与已知参考基因组MYB44基因的序列一致性为100%,此基因的编码区长为807 bp。运用NCBI ORFfinder 进行分析，发现该阅读框编码268个氨基酸，将该基因命名为LsMYB44。
注：1、2、3、4、5分别为红光，蓝光，在白光基础上添加比例为2∶1，1∶1和1∶2的处理Note: 1,2,3,4,5 refer to red light,blue light and white light with the addition ratio of 2∶1,1∶1 and 1∶2 respectively图1 叶用莴苣LsMYB44基因的克隆Fig.1 Cloning ofLsMYB44 gene
2.2 叶用莴苣LsMYB44转录因子的生物信息学分析
2.2.1LsMYB44转录因子的保守结构域分析 通过NCBI在线工具Conservation Domain程序对转录因子进行基因保守结构域分析，结果发现生菜MYB44除了具有1个典型的MYB保守结构域，同时还含有2个SANT、1个PLN03212和REB1结构域，属于R2R3-MYB家族成员(图2)。
图2 LsMYB44转录因子的保守结构域分析Fig.2 Conserved domain of LsMYB44 TF
2.2.2LsMYB44转录因子所编码蛋白理化性质 运用ProtParam软件对LsMYB44所编码的氨基酸序列进行分析，结果表明LsMYB44蛋白的相对分子质量为29 341.14 Da，理论等电点为8.37。所编码的氨基酸中，丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸和谷氨酸的含量较多，分别为13.1%、 10.4%、7.8%、7.1%、7.1%，色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的含量较少，分别为1.9%、1.5%和0.7%，带负电的残基总数(Asp+Glu)26个，带正电的残基总数(Arg+Lys)28个，不稳定指数为60.19，为不稳定蛋白。亲水性平均值为-0.512，预测为亲水性蛋白(图3)。
图3 LsMYB44蛋白的理化性质Fig.3 Physical and chemical properties of LsMYB44 protein
2.2.3LsMYB44转录因子所编码蛋白信号肽分析、跨膜预测及亚细胞定位 经SignalP 5.0分析，该蛋白无信号肽。所编码的氨基酸也不在跨膜区，说明LsMYB44蛋白不含跨膜结构，不属于分泌蛋白(图4)。使用Psort软件预测LsMYB44蛋白质的亚细胞定位，结果显示该蛋白定位于细胞核。
图4 LsMYB44蛋白的信号肽分析及跨膜预测Fig.4 Signal peptide analysis and transmembrane prediction of LsMYB44 protein
2.2.4LsMYB44转录因子所编码蛋白二级及三级结构预测 二级结构预测显示LsMYB44主要以无规则卷曲和α-螺旋为主，含少量的β折叠。其中无规则卷曲有170个氨基酸，占63.43%；
有69个氨基酸组成α螺旋，占25.75%；
延伸链有23个氨基酸，占8.58%；
β折叠有6个氨基酸，占2.24%。同时利用Swiss Model 软件对LsMYB44进行同源建模，推测该蛋白的三级结构(图5)。
图5 LsMYB44蛋白的二级、三级结构预测Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of LsMYB44 protein
2.3 叶用莴苣LsMYBB44转录因子的系统进化分析
将得到的LsMYB44的氨基酸序列在NCBI数据库中进行比对，发现它与洋蓟(XM_025121970 )、向日葵(XM_022159869)、薇甘菊( KAD0377770.1)等植物中的MYB44具有同源性。利用MEGA
7.0软件来构建系统进化树，发现叶用莴苣同洋蓟的亲缘关系最近，二者同为菊科属植物，其次为向日葵。雷蒙德氏棉和木槿花为一类(图6)。
图6 LsMYB44转录因子的系统进化树Fig.6 Phylogenetic analysis of LsMYB44
2.4 叶用莴苣LsMYB44转录因子启动子顺式作用元件分析
利用Plant CARE软件对转录组测序得到的LsMYB44基因启动子序列上的顺式作用元件预测分析，筛选保留有一定查看目的元件,发现了参与光反应的GT1-motif、I-box元件，参与MeJA反应的CGTCA-motif、TGACG-motif元件，参与生长素反应的TGA-element、AuxRR-core元件以及参与低温反应的LTR元件等(表2)。结果表明LsMYB44与光响应、逆境胁迫以及激素响应等有关。
表2 LsMYB44基因启动子顺式作用元件分析Tab.2 Analysis of cis acting elements of LsMYB44 gene promoter
2.5 叶用莴苣LsMYB44基因表达分析
与对照组白光相比，单色光和复色光处理下LsMYB44基因的表达量均有所下降，但在蓝光处理条件下下调了将近3倍(图7)，而前期研究表明在蓝光处理下花色苷化合物是明显增加的，这表明不同光质处理对LsMYB44基因的表达有影响，从而影响花色苷的合成，由此推测LsMYB44基因在不同光质处理下叶用莴苣花色苷合成中发挥负调节作用。
注：CK,RL,BL,R2B1L,R1B1L,R1B2L分别表示白光，红光，蓝光，红光和蓝光的比分别为2∶1,1∶1,1∶2Note:CK,RL,BL,R2B1L,R1B1L,R1B2L represent white light、red light、blue light、red light and blue：light is 2∶1，1∶1 and 1∶2 respectively图7 LsMYB44基因在不同光质处理下的表达量分析Fig.7 Expression analysis of LsMYB44 gene under different light quality treatments
光质对次生代谢物的产生具有重要影响，而次生代谢物的含量影响食物的品质特性。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，研究表明MYB转录因子在苯丙烷类次生代谢过程中发挥着重要作用[12]。根据MYB转录因子的MYB-DNA结合域的特点可分为1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB和4R-MYB四个亚族，而R2R3-MYB转录因子作为数量最多的MYB家族之一，在调控次生代谢和逆境胁迫等方面发挥着重要作用[13-14]。MYB44是典型的R2R3-MYB家族转录因子，具有保守的结构基因，现研究表明，MYB44广泛参与植物激素信号传导途径、病虫害防御、机械损伤和环境胁迫的响应，具有重要的生物学意义[15]。
本研究通过转录组数据，筛选出MYB44基因，克隆得到cDNA序列807bp，编码268个氨基酸，命名为LsMYB44。LsMYB44蛋白的相对分子量为29.341kDa，等电点为8.37，偏碱性。平均亲水数-0.512，不稳定系数为60.19，属于不稳定蛋白。具有1个典型的MYB保守结构域，同时还含有2个SANT、1个PLN03212和REB1结构域。将LsMYB44的氨基酸序列在NCBI数据库中进行比对，发现它与洋蓟、向日葵、薇甘菊等植物中的MYB44具有同源性。对LsMYB44基因启动子上的顺式作用元件分析表明与光响应、激素和逆境胁迫有关。实时荧光定量PCR分析显示，LsMYB44基因在蓝光处理下明显下调，而我们前期的研究表明蓝光处理下紫叶生菜花色苷是明显增加的。在马铃薯中也发现了类似的结果，高温通过增强MYB44的表达显著降低了块茎花青素色素含量[16]。表明LsMYB44可能在不同光质(包括蓝光)处理下负调控紫叶花色苷的生成，但具体作用机制还有待研究。
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