覃顺旺，王跃华*，俸世洪，文诗玉，阎婷婷，张益嘉
(1.成都大学药学院，四川成都 610106；
2.成都第一制药有限公司，四川成都 610930；
3.成都大学食品与生物工程学院，四川成都 610106)
山莨菪[Anisodustanguticus(Maxim.)Pascher]为茄科山莨菪属多年生宿根草本植物，是青藏高原上特有的药用植物;生长环境是海拔2 200～4 200 m的土坡、河滩及避风向阳的山谷[1-3]。山莨菪始载于《月王药诊》，药用历史悠长，藏族民间以根或种子入药，其药效成分主要是莨菪烷类生物碱，具有镇静麻醉、止痛解痉、止咳平喘等功效[4-6]。山莨菪植物在自然条件下，通常是通过种子繁殖，但存在种子萌发率低、出苗时间长和出苗不整齐等问题，严重影响山莨菪大规模的人工繁育，且过度采挖导致山莨菪野生资源破坏严重，现已被列为《中国国家重点保护野生植物名录》二级保护植物[7-9]。
开展山莨菪种子的组织培养消毒技术研究，高效获取大量优质无菌苗，不仅为山莨菪快繁体系建立奠定基础，也为其育种研究、基因工程和植物脱毒苗生产等提供材料，有利于山莨菪资源的保护和进一步开发利用。山莨菪种皮十分坚硬，抑制种子萌发，且种子表面布满褶皱，易隐藏大量的微生物，极大增加了山莨菪种子在组培过程中的消毒难度。因此，建立一套染菌率低、萌发率高的山莨菪种子消毒方法是至关重要的。该试验以成熟的山莨菪种子为材料，研究不同消毒剂和消毒时间对山莨菪种子消毒和萌发的影响，从中筛选出最佳的消毒处理组合，为大规模工业化生产山莨菪优质无菌苗提供科学依据。
1.1 材料山莨菪种子于2021年8月份采自青海省西宁市湟中县，经四川师范大学马丹炜教授鉴定为茄科山莨菪属植物山莨菪[Anisodustanguticus(Maxim.)Pascher]的种子。采集的种子待其自然干燥后，置于4 ℃储存。
试验药品HgCl2(含量>99.5%)购于利祥汞业化工有限公司；
NaClO(有效氯含量>8%)购于西陇科学股份有限公司；
C2H5OH(含量>99.7%)购于成都市科隆化学品有限公司。
1.2 方法
1.2.1升汞消毒处理。将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，放入超净工作台。先使用75%乙醇预处理30 s 后，再使用0.05%的升汞溶液分别处理0(对照组)、2、4、6、8、10和12 min，蒸馏水清洗5次。后续处理置于0.08%(m/m)的无菌赤霉素(GA3)溶液中浸泡24 h，经蒸馏水清洗3次后，接种于含有3%蔗糖+0.7%琼脂的MS培养基上，置于温度为(22±1)℃的黑暗条件下进行种子萌发培养。
1.2.2次氯酸钠消毒处理。将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，放入超净工作台。先使用75%乙醇预处理30 s后，再使用25%、50%和75%的次氯酸钠溶液分别处理0(对照组)、10、20和30 min，蒸馏水清洗5次。后续处理与“1.2.1”项下相同。
1.2.3消毒剂组合消毒处理。将山莨菪种子用蒸馏水清洗3次，去除漂浮的种子，放入超净工作台。在上述单因素试验的基础上，设计3因素3水平正交试验，即采用75%乙醇、75%次氯酸钠和0.05%升汞对山莨菪种子进行联合消毒处理，每种消毒剂使用后都用蒸馏水清洗4次。后续处理与“1.2.1”项下相同。
1.3 数据统计分析利用SPSS 23.0和和Excel 2019对试验数据进行统计分析。
种子萌发的标准是胚根突破种皮0.3 cm以上。计算公式如下：
种子萌发率=萌发种子数/接种种子总数×100%
种子染菌率=污染种子数/接种种子总数×100%
2.1 升汞对山莨菪种子消毒和萌发的影响试验采用0.05%的升汞溶液分别对山莨菪种子进行不同时间的消毒处理，18 d后统计各组山莨菪种子的染菌率和萌发率。从表1可以看出，当0.05%的升汞溶液处理2 min时，山莨菪种子的染菌率最高，为40.0%，但萌发率也最高，为59.2%；
当0.05%的升汞溶液处理12 min时，种子的染菌率最低，仅为5.8%，萌发率也最低，仅为22.5%。通过与对照组(CK)的比较可知，0.05%的升汞溶液对山莨菪种子的萌发具有抑制作用，处理时间越久，抑制作用越强，但消毒效果越好。
由表1可知，0.05%的升汞消毒时间在2～12 min，随着消毒时间的不断增加，山莨菪种子的染菌率和萌发率均呈下降趋势，染菌率从最高的40.0%下降至5.8%，萌发率从最高的59.2%下降至22.5%。这是因为山莨菪种子表面凹凸不平，布满大量沟状褶皱，其中易滋生大量的病菌；
同时，粗糙的表面产生大量气泡依附在种子表面，很大程度上阻碍了升汞溶液与山莨菪种子表面的直接接触，大大地降低了升汞的消毒效果(图2)；
若延长消毒时间，消毒剂升汞(HgCl2)溶液的重金属离子会造成植物种胚损伤，进而抑制生长，最终表现为种子萌发率也大大降低[10-12]。
表1 升汞对山莨菪种子消毒的影响
图2 山莨菪种子(A)及其消毒过程中种皮表面产生的气泡(B)Fig.2 Anisodus tanguticus seeds(A)and the bubbles generated on the seed coat surface during sterilization(B)
2.2 次氯酸钠对山莨菪种子消毒和萌发的影响该试验采用浓度为25%、50%和75%的次氯酸钠溶液对山莨菪种子分别进行10、20和30 min的消毒处理，9 d后统计山莨菪种子的染菌率和萌发率。从表2可以看出，当使用25%次氯酸钠消毒10 min时，种子的污染率最高，达到了43.3%；
当使用75%次氯酸钠消毒30 min时，种子的消毒效果最好，污染率为0，但此时的萌发率仅为10.0%，远低于75%次氯酸钠消毒10 min时的萌发率(94.6%)。通过与对照组的萌发率比较可知，通常情况下次氯酸钠对山莨菪种子的萌发具有促进作用，这是因为山莨菪坚硬的种皮抑制萌发[13]，而次氯酸钠的腐蚀作用能削弱种皮，促进萌发；
但浓度过大、消毒时间过长的情况下，次氯酸钠也会损伤种胚，严重抑制萌发。
表2 次氯酸钠溶液对山莨菪种子消毒和萌发的影响
由表2可知，从山莨菪种子染菌率的试验结果来看，随着3种不同浓度的次氯酸钠消毒时间由10 min增加至30 min，各组种子的染菌率均呈明显下降趋势。从山莨菪种子萌发率的试验结果来看，其种子的萌发率变化趋势有2种情况：①当采用25%次氯酸钠处理种子时，随着消毒时间由10 min增加至30 min，种子萌发率呈逐渐增加趋势，当消毒时间为30 min时，山莨菪种子的萌发率可达到85.8%；
②当采用50%或75%的次氯酸钠溶液消毒山莨菪种子时，随着消毒时间由10 min增加至30 min，种子萌发率呈逐渐下降趋势，其中山莨菪种子萌发率最高的处理是采用75%次氯酸钠消毒10 min，其种子萌发率最高，为94.6%。
2.3 不同消毒组合对山莨菪种子消毒和萌发的影响从上述使用升汞或次氯酸钠对山莨菪种子消毒的试验结果发现，为了获得山莨菪种子高的萌发率与低的污染率的双重效果，还需通过正交试验开展进一步研究，9 d后统计试验结果见表3。在以染菌率为指标时，通过极差(R)分析表明3个因素的影响从大到小依次为C>B>A，即0.05%升汞的影响最大，75%次氯酸钠次之，75%乙醇影响最小；
根据各水平的均值大小，推理出山莨菪种子消毒的最佳组合为A1B3C3，即75%乙醇0.5 min+75%次氯酸钠15 min+0.05%升汞1.5 min，正交表中找到对应的试验组合，山莨菪种子萌发率达到90.0%，染菌率为0。在以萌发率为指标时，通过极差分析3个因素的影响从大到小依次为C>A>B，即0.05%升汞的影响最大，75%乙醇次之，75%次氯酸钠影响最小；
根据各水平的均值大小来看，推理出山莨菪种子萌发的最佳组合为A1B3C1，即75%乙醇0.5 min+75%次氯酸钠15 min+0.05%升汞 0.5 min，因正交试验表中没有与推导出的最佳消毒方法对应的试验组合，故进行验证试验，试验结果表明此条件下山莨菪种子萌发率为93.8%，染菌率为18.8%。
表3 正交试验设计与结果分析
由方差分析(表4)可知，在3个因素中，因素C即升汞对山莨菪种子的消毒具有极显著影响，升汞消毒在降低染菌率方面起着关键作用。因素A、B和C对山莨菪种子萌发都具有显著影响，表明山莨菪种子的萌发对3种消毒剂的处理都较敏感，需要控制好消毒时间，保障种子的萌发率。
表4 方差分析
根据正交试验结果，综合考虑山莨菪种子的染菌率和萌发率，该研究采用A1B3C3作为山莨菪种子消毒的最佳方法，即75%乙醇消毒0.5 min+75%次氯酸钠消毒15 min+0.05%升汞消毒1.5 min，此时山莨菪种子的萌发率为90.0%，染菌率为0。
山莨菪种子种皮质地坚硬，导致种子不透水、不透气且萌发受到机械阻碍，这是自然状态下山莨菪种子萌发低的原因[14]；
同时山莨菪种子表面粗糙、布满褶皱，微生物极易隐藏在其中，消毒工作十分困难。在组织培养中，为了获得山莨菪种子低污染率和高萌发率的双重效果，该试验研究了不同的消毒剂和消毒时间对其消毒和萌发的影响。首先开展了升汞和次氯酸钠单因素试验，结果表明2种消毒剂单独使用都不能获得良好的效果。为此在单因素试验的基础上，综合考虑染菌率和萌发率，设计了乙醇、次氯酸钠和升汞的正交试验，得到山莨菪种子的最佳消毒方式为75%乙醇消毒0.5 min+75%次氯酸钠消毒15 min+0.05%升汞消毒1.5 min，山莨菪种子的萌发率可达90.0%，染菌率最低为0。消毒剂组合消毒效果良好，认为主要是次氯酸钠具有腐蚀山莨菪坚硬种皮的作用，使得本来坚硬且凹凸不平、布满褶皱的种皮变得较平滑和较薄软，接着再使用一定浓度的升汞溶液消毒就能达到很好的消毒效果，并且山莨菪种子胚根也更容易突破处理后的种皮，消毒剂的联合使用消毒效果更好，萌发率更高。
大量报道显示，通过种子消毒得到无菌苗的过程，受到诸多因素的影响，如消毒剂种类、浓度、消毒时间、种皮厚度、种子休眠程度等，因此，根据种子自身特性选择合适的消毒方法至关重要[15-16]。消毒方法不仅关乎种子的染菌率，同样对种子的萌发率也具有较大的影响[17]。该研究以消毒效果和萌发率为依据，获得了组织培养中山莨菪种子的最佳消毒方法，为山莨菪野生资源保护与大规模生产山莨菪优质种苗奠定基础。
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