许文雅，张宏宏，林洋，刘瀛，郁蕉竹，鞠晓莹
沈阳市食品药品检验所（沈阳 110122）
纽甜是一种合成甜味剂，其甜味纯正，口味较接近蔗糖，但其甜度高，甜度是蔗糖的8 000～13 000倍，且无能量[1-3]，纽甜在体内代谢后的产物能较快排出体外。纽甜稳定性好、安全性高，因此被广泛应用在食品行业中[4-5]。
白酒是通过粮食发酵等一系列工艺酿造的蒸馏酒，经过时间的发酵和精良的工艺，使酒中含有丰富的多元醇或酮等甜味物质，这些物质使白酒的口感更香醇。但有些酒类生产企业为了降低生产成本、改善白酒的口感，在生产过程中添加甜味剂，这种违规添加行为影响了酒类行业发展的食品安全问题[6-7]。依据GB 2760—2014[8]《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定，发酵酒中不得添加甜味剂，白酒中不允许添加纽甜。
关于白酒中纽甜的检测方法国内外已有大量报道，主要检测方法有高效液相色谱法[9-14]、液相质谱法[15-18]等，但液相质谱法运营成本相对较高。目前，高效液相色谱法应用较多，其中GB 5009.247—2016[19]《食品安全国家标准 食品中纽甜的测定》应用较多，该方法是样品经过混合提取液提取、C18固相萃取柱净化、氮吹浓缩等前处理步骤，处理过程较为复杂，影响因素多，导致回收率低。因此试验在国标法基础上，优化白酒中纽甜的前处理过程和高效液相色谱条件，为测定白酒中纽甜的含量提供一种简单快速、精密度高、回收率好、成本低的检测方法。
1.1 材料与试剂
纽甜标准品（1 000 mg/L，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司）；
乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；
乙酸铵（色谱纯，fisher chemical）；
辛烷磺酸钠（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；
磷酸二氢钾（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；
磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
超纯水（电导率：18.2 MΩ.cm，25 ℃，自制）；
水系滤膜（0.45 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。
30个不同厂家白酒样品：市场购买。
1.2 仪器与设备
Waters e2695高效液相色谱仪（配2998PDA检测器，美国Waters公司）；
BSA224S-CW分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；
Quintix213-1CN电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；
KQ-250DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
H1750R高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；
Milli-Q reference超纯水机（Millipore SAS公司）；
705878（20-200 μL）/705880（100-1 000 μL）移液器（普兰德公司）；
NZ44739（5-50 μL）移液器（赛默飞世尔科技公司）。
1.3 试验条件
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Thermo C18柱，4.6 mm×150 mm，5 μm；
流动相：乙腈-辛烷磺酸钠溶液40∶60（V/V）；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30 ℃；
进样量：50 μL；
波长：210 nm。
1.3.2 样品的前处理条件
精确称取5 mL白酒于10 mL玻璃刻度管中，于氮吹仪中除去乙醇，取出后用水定容至刻度，充分混匀，滤液经0.45 μm滤膜过滤，供高效液相色谱检测。
1.3.3 溶液的配制
辛烷磺酸钠溶液：称取2.00 g辛烷磺酸钠用水溶解，加1 mL磷酸，加水定容至1 000 mL。
100 mg/L纽甜储备液：准确量取1.0 mL纽甜标准物质，于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
标准曲线溶液：分别准确移取100 mg/L的纽甜储备液0.02，0.05，0.1，0.5和1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水定容到刻度，轻摇混匀，标准系列工作溶液中纽甜的质量浓度分别为0.2，0.5，1.0，5.0和10 mg/L。
2.1 前处理条件的选择与比较
国标方法采用甲酸和三乙胺混合提取液提取、超声，通过固相萃取柱净化，氮吹后再用甲醇洗脱，处理过程繁琐，易导致样品中的纽甜损失大，回收率偏低，且固相萃取柱的成本高。白酒基质较为纯净，有研究表明纽甜在水溶液中稳定性好[20]，但白酒样品中含有乙醇，在低波长下直接进样容易出现干扰峰，因此试验中先挥发掉乙醇，再用水定容至原体积。在相同的色谱条件下进样分析，图1是纽甜标准溶液色谱图，图2是白酒样品直接进样溶液色谱图，图3是白酒除去乙醇后溶液色谱图，图2和图3对比可以看出，直接进样后得到的色谱图杂质峰多，特别是在纽甜出峰位置附近有干扰峰，若保留时间稍有偏移，就会造成目标峰识别错误，造成纽甜含量变化，导致定量结果不准确。相对于直接进样来说，除去乙醇后色谱图中纽甜出峰位置附近的干扰峰较少，从而提高了目标峰识别的正确率，保证了定量的准确性。通过直接进样和除去乙醇两种方式比较，首先确定了除去乙醇后再进样的前处理方式。
图1 纽甜标准溶液色谱图
图2 白酒样品直接进样溶液色谱图
图3 白酒样品除乙醇后溶液色谱图
国标方法采用甲酸和三乙胺混合提取液提取、超声，通过固相萃取柱净化，氮吹后再用甲醇洗脱，处理过程繁琐，易导致样品中的纽甜损失大，回收率偏低，且固相萃取柱的成本高。此方法通过取白酒试样先氮吹除去乙醇，再用水定容后直接上机检测，尽可能做到无损失。对国标方法和本方法分别进行加标试验，平行测定3次，测得纽甜的回收率，得到的试验结果如表1所示。结果表明，白酒除去乙醇后，用水定容后上机得到的纽甜回收率高。图4是白酒除乙醇后加标溶液色谱图。
表1 两种前处理方法回收率比较 单位：%
图4 白酒除乙醇后加标溶液色谱图
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 流动相及洗脱条件的选择
试验选取了甲醇-辛烷磺酸钠溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液作为流动相进行分析。通过试验结果发现，使用甲醇-辛烷磺酸钠溶液为流动相，纽甜的峰形不好，乙腈-辛烷磺酸钠溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液为流动相时，纽甜峰形对称性较好，均能有效地分离杂质，但乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-乙酸铵溶液作为流动相时，样品中的杂质峰较大，基线不如乙腈-辛烷磺酸钠体系平稳，因此选择乙腈-辛烷磺酸钠溶液为流动相。国标中流动相的洗脱方式是梯度洗脱，在梯度洗脱过程中可能会出现基线漂移的情况，且耗时较长，由于白酒的成分比较简单，等度洗脱也能够较好地分离纽甜，对梯度洗脱方式和等度洗脱方式分别进行了考察，试验结果表明，两种洗脱方式无明显差异，所以试验采用乙腈-辛烷磺酸钠溶液等度洗脱的方式。乙腈-辛烷磺酸钠溶液比例为（40∶60）洗脱时，纽甜与样品中的杂质分离良好，出峰时间快。
色谱柱选用了Thermo C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）进行色谱分离，国标中使用C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），两种色谱柱所分离出的目标化合物的峰形，分离度都满足要求，考虑250 mm色谱柱的出峰时间更长，成本更高，所以采用150 mm色谱柱，纽甜标准溶液色谱图见图1。
2.2.2 检测波长的选择
利用二极管阵列检测器（PDA）对纽甜标准品溶液在波长190～400 nm范围内扫描，光谱图显示，纽甜在200～218 nm范围内都有吸收，随着波长增加，吸收值逐渐下降，但考虑到乙腈在210 nm以下有紫外末端吸收，因此选择检测波长为210 nm。
2.3 在优化条件下进行方法验证及白酒中纽甜的检测
2.3.1 线性范围
分别取0.2，0.5，1.0，5.0和10 mg/L的纽甜标准溶液进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，线性回归方程为Y=38 814X-825，相关系数为0.999 978，标准曲线如图5。结果表明纽甜在0.2～10 mg/L线性关系良好。
图5 纽甜标准曲线图
2.3.2 检出限和定量限
以3倍信噪比（rSN）测得纽甜检出限为0.06 mg/kg，以10倍信噪比（rSN）测得纽甜定量限为0.2 mg/kg，表明该色谱条件具有较高的检测灵敏度，能准确进行定量，满足GB 5009.247—2016[19]的要求。
2.3.3 加标回收率和精密度
选取白酒空白基质样品，分别加入一定量的纽甜标准溶液，使样品中纽甜的添加量分别为0.2，0.5和1.0 mg/kg，每个质量分数水平分别做6组平行试样，按上述前处理条件和色谱条件测定样品中的纽甜含量，并计算其加标回收率和精密度，结果见表2。由表2可知，纽甜加标平均回收率为97.1%～99.0%，三个不同水平下的精密度分别为1.3%，1.1%和0.39%，满足GB/T 27404—2008[21]《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求，说明方法的准确度和精密度良好。
表2 回收率试验结果
2.4 实际样品的检测
从市场上抽取30个不同厂家的白酒样品，按上述优化后的处理方法进行纽甜的快速检测，结果表明，29份样品中未检出纽甜，1份样品中有纽甜检出，含量为0.810 mg/kg，纽甜的出峰时间稳定，分离度良好。表明白酒市场存在非法添加甜味剂的现象，相关部门应对此现象进行关注。阳性样品色谱图见图6。
图6 阳性样品色谱图
建立了快速测定白酒中纽甜含量的高效液相色谱法，在GB 5009.247—2016[19]《食品安全国家标准食品中纽甜的测定》的基础上，简化了纽甜检测的前处理方法，优化了液相条件，将其用于对白酒中纽甜含量的检测。以乙腈-辛烷磺酸钠溶液（40∶60，V/V）为流动相，检测波长210 nm，能够获得良好的响应和分离度。在白酒的前处理过程中，样品利用氮吹仪除乙醇后用水定容，操作简单。试验结果表明：纽甜在0.2～10 mg/L质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系，灵敏度高，方法检出限为0.06 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg；
准确度高，3个不同添加量水平下纽甜平均加标回收率为97.1%～99.0%；
重复性好，相对标准偏差（n=6）为0.39%～1.3%。相较于国标方法复杂的前处理过程以及回收率不稳定的情况，该方法前处理简单快速，检测时间短，方法准确度高，精密度好，检测成本低，可快速有效地测定白酒中的纽甜，满足日常检测的要求，为检测白酒中的纽甜提供了一种经济快速的方法。