王一名，卫晓红，王忠一，于晓静，吴帅
（烟台市食品药品检验检测中心，山东烟台 264000）
类黄酮化合物是自然界存在的酚类化合物中最大的一个亚类，在植物中广泛存在。其基本骨架具有C6=C3=C6结构，即由2个芳香环A和B，通过中央三碳链相互连结而成。已经有4000多种类黄酮化合物被分离鉴定，由于化学结构的不同，这些化合物呈现出不同的特性。葡萄酒中的类黄酮根据其结构分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮和黄烷-3-醇等，主要包括槲皮素、杨梅素、儿茶素等组分。类黄酮物质是葡萄酒中主要的苦味及涩味物质[1-3]，构成了葡萄酒的基本骨架，有助于增强酒的结构感。在葡萄酒成熟过程中，这些苦味、涩味和酸味物质发生变化，形成复杂的聚合物，提高味感质量。此外，类黄酮具有抗氧化的功效，通过自身氧化可降低葡萄酒变质的速度，有利于葡萄酒成熟过程中醇香的产生。在植物体内的多酚物质中，多数类黄酮化合物具有生理或药理活性，对人体健康有重要作用[4]，除了可作为抗氧化剂和自由基清除剂[5]外，还能抗炎、抑菌、抗病毒、预防高血压以及抑制血栓形成等[6-7]。越来越多的研究表明，类黄酮化合物具有很高的医用价值，如山奈酚和槲皮素具有抗癌、心脏保护和抗炎作用[8]；
槲皮素对心血管疾病高危人群的健康有积极影响；
柚皮素具有神经保护和抗氧化特性[9]。因此，研究建立一种简便、快速、准确、灵敏并能够同时测定葡萄酒中多项类黄酮组分的分析方法显得尤为重要。
目前，检测类黄酮的方法主要有分光光度法[10]、高效液相色谱法[11]、薄层色谱法[12]、毛细管电泳法[13]、核磁共振法[14]、液相色谱-质谱联用法[15-16]和红外光谱法[17]等。近年来，液相色谱-质谱联用法以准确度高、灵敏度好、分析速度快等特点已广泛应用于类黄酮检测的各个领域，包括植物[18-19]、中成药[20]和食品[21]等，如毛慧慧等[22]采用液质联用技术分离鉴定了银线莲中两种黄酮类化合物，白海玉等[23]利用液质联用技术对野菊花中的黄酮成分进行了分析，均取得良好的效果。但是，采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLCMS/MS），对葡萄酒进行多指标类黄酮化合物的定量分析却少见报道。迄今为止，对葡萄酒中酚类物质的研究报道仍以生物活性、感官特性等为主。本研究建立了一种测定葡萄酒中17种类黄酮物质含量的超高效液相色谱-串联质谱法，对葡萄酒中类黄酮化合物的含量进行了定量分析，结果准确、可靠，可以作为葡萄酒中类黄酮物质定量检测的技术依据，为葡萄酒中这类化合物的综合分析提供参考。
1.1 主要仪器与试剂
TQ-S超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Waters公司）；
赛多利斯CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；
Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）。
标准品（纯度≥98%）：花旗松素（Taxifolin）、杨梅素（Myricetin）、杨梅苷（Myricitrin）、表儿茶素（Epicatechin）、儿茶素（Catechin）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin），购自成都普菲德生物技术有限公司；
槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、芦丁（Rutin）、刺槐苷（Robinin），购自成都普瑞法科技开发有限公司；
柚皮素（Naringenin）、没食子儿茶素（Gallocatechin），购自上海安谱实验科技股份有限公司；
金丝桃苷（Quercetin-3-galactoside）、异槲皮苷（Quercetin-3-O-glucodise），购自上海甄准生物科技有限公司；
表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate），购自坛墨质检；
水仙苷（Isorhamnetin-3-O-glucoside），购自Panphy-chemicals。葡萄酒购买于超市。
甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；
实验用纯水由Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）制备。
1.2 实验条件
1.2.1 UPLC条件
色谱柱为HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国Waters公司）；
流动相A为有机相（0.1%甲酸-乙腈溶液），B为水相（0.1%甲酸-水溶液）；
柱温35 ℃；
流速300 μL·min-1；
进样量2 μL。洗脱程序见表1。
表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phases
1.2.2 MS条件
电喷雾离子源（ESI），同时采用ESI＋（毛细管电压3.5 kV）和ESI-（毛细管电压2.9 kV）模式切换扫描；
多反应监测模式（MRM）；
离子源温度为150 ℃，去溶剂气温度为500 ℃，去溶剂气流量为1000 L·h-1，锥孔气流量为150 L·h-1，碰撞气流量为0.15 mL·min-1。类黄酮化合物的定性/定量离子对、碰撞能量（CE）及锥孔电压（CV）见表2。
1.3 实验方法
1.3.1 标准品溶液和模拟酒基的配制
将标准品用甲醇溶液配制成1000 mg·L-1的标准储备液，置于﹣20 ℃保存备用。使用时，将标准储备液用甲醇溶液逐级稀释成所需标准工作液，且现用现配。
取120 mL食用酒精和5 g食品级酒石酸，移到1 L容量瓶中，用去离子水定容，即得到模拟酒基。
1.3.2 样品处理
葡萄酒在分析前室温避光保存。开瓶后，马上转移到棕色瓶中，以避免氧化，置于﹣4 ℃避光保存。上机前取2 mL样品过0.22 μm滤膜过滤，也可以根据实际测定结果取样1 mL稀释至适当浓度，过滤膜后上机分析。
2.1 质谱参数优化
为获得各待测化合物的最优质谱参数，本研究利用注射泵直接进样，将1 mg·L-1的标准工作液以0.01 mL·min-1流速注入离子源，分别测定了每一种化合物在ESI＋和ESI-模式下的质谱信号强度。由于类黄酮类化合物结构中既具有-OH基团，又具有碱性O原子[24]，因此在正、负离子模式下均具有相应的质谱信号。通过对比后发现，槲皮素、山奈酚、杨梅苷、芦丁等在正离子模式下的响应强度较强，因此选择ESI＋电离模式；
而柚皮素、杨梅素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等化合物在负离子模式下的响应强度较强，因此选择ESI-电离模式。在各化合物最优的离子化模式下，分别对母离子进行碰撞解离，二级扫描得到裂解碎片离子。通过对CE的优化选取响应值高、干扰小的碎片离子用于定性和定量分析。优化后的质谱参数见表2。
表2 类黄酮化合物的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of flavonoid compounds
2.2 色谱条件优化
2.2.1 色谱柱
试验考察了待测物在HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱和C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱的保留情况，主要有峰形和响应值两个方面的差异。从峰形来看，除表儿茶素、金丝桃苷和异槲皮苷外，其它化合物在两只色谱柱上相差不大。在T3色谱柱上，表儿茶素、金丝桃苷和异槲皮苷的分离效果明显优于C18，分别见图1和图2。从响应值来看，所有待测物在T3色谱柱上的响应信号均高于C18。其中，刺槐苷、表儿茶素、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯在T3上的响应值比C18高约51%～100%；
其余化合物在T3上的响应值高约14%～47%。综合考虑色谱峰的分离效果和响应信号，选择T3作为分析用色谱柱。
图1 表儿茶素在不同色谱柱中的峰形对比Figure 1 Peak comparison of epicatechin in different chromatographic columns
图2 金丝桃苷和异槲皮苷在不同色谱柱中的峰形对比Figure 2 Peak comparison of quercetin-3-galactoside and quercetin-3-O-glucodise in different chromatographic columns
2.2.2 流动相
考察了17项类黄酮化合物在不同流动相条件下的分离情况，结果表明在仅含有乙腈和水的液相条件下，花旗松素、杨梅素、山奈酚、表儿茶素没食子酸酯等化合物分离效果不佳，且峰形拖尾严重。在流动相中添加甲酸后这些化合物的分离效果改善，色谱图更窄、更对称且多数化合物的响应更强。待测物在3种流动相Ⅰ（0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，Vol，下同）、Ⅱ（乙腈-0.1%甲酸水溶液）和Ⅲ（乙腈-水）中的响应值对比如图3所示：以待测物在流动相Ⅰ中的响应强度为参照，柚皮素、刺槐苷、表儿茶素、儿茶素、水仙苷等5种化合物在流动相Ⅲ中的响应值高约29%～39%，但花旗松素、杨梅素、杨梅苷、没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯在流动相Ⅲ中的响应值不足50%；
待测物在流动相Ⅰ和Ⅱ中的响应差值在30%以内，17种化合物中仅杨梅苷、山奈酚、柚皮素在流动相Ⅱ中的响应值高于Ⅰ，其余14种化合物在流动相Ⅱ中的响应值低于Ⅰ。因此，最终选用含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液作为流动相。
图3 不同流动相中的响应值对比Figure 3 Comparison of response value in different mobile phases
2.3 样品处理方法的优化
葡萄酒样品不经处理直接进样时，样品中的杂质会对色谱柱和仪器造成污染。因此，选择将酒样稀释适当倍数后过0.22 μm微孔滤膜处理较好。滤膜在去除杂质的同时，也会吸附部分待测物。不同材质的滤膜吸附能力不同。本文选用聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏氟乙烯（PVDF）和尼龙（Nylon）三种型号的滤膜进行对比试验。在模拟酒基中添加固定浓度的标准品溶液，经滤膜过滤后，计算目标物的回收率，结果见图4。由图4可知，山奈酚在PTFE上的回收率最低，为70.9%，其余待测物在PTFE上的回收率均大于80%。除刺槐苷、没食子儿茶素和水仙苷外，其它待测物在PTFE上的回收率均高于PVDF。Nylon对待测物的吸附效果最强，通过率最低。因此，本试验选择过0.22 μm PTFE滤膜作为样品的前处理方式。
图4 滤膜类型对回收率的影响Figure 4 Effect of membrane type on recovery rate
2.4 方法学验证
2.4.1 线性关系、检出限与定量限
将混合标准储备液用甲醇配制成系列浓度工作溶液后按1.2实验条件上机检测。以标准品的质量浓度为横坐标（X），仪器响应值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算得出线性方程和相关系数，以3倍信噪比为检出限（LOD），10倍信噪比为定量限（LOQ），结果见表3。由表3可知，待测物在质量浓度范围内均呈良好的线性关系，标准曲线的线性相关系数R均大于0.99，LOD和LOQ分别为0.1～5 μg·L-1和0.3～12 μg·L-1。
表3 线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients, the limits of detection and quantification
2.4.2 精密度与重复性
取同一混合标准品溶液于同日不同时间点重复进样7次以及连续7 d重复测定3次，按照本方法测定类黄酮化合物的峰面积，计算其相对标准偏差，分析待测物的日内精密度及日间精密度，结果见表4。从表4中可以看出，各待测物峰面积的日内和日间相对标准偏差（RSD）分别在0.92%～3.94%和1.75%～5.66%，表明该仪器具有良好的精密度。在1.3.1模拟酒基溶液中定量加入混合标准品溶液制备7份供试品，按1.3.2处理后进样分析，计算各待测物的重复性RSD为1.42%～5.05%（表4），表明该方法的重复性良好。
表4 精密度与重复性实验结果Table 4 Results of precision and repeatability
2.4.3 加标回收率
对实际样品的分析表明，不同样品中各组分浓度差异较大，因此在进行加标回收试验时，依据各组分在实际样品中的含量高低，在1.3.1模拟酒基溶液中加入混合标准品溶液分别制成不同质量浓度水平的供试品溶液，每个水平做7个平行，按照1.3.2处理后进样分析，计算各待测物的加标回收率和RSD，结果见表5。表5显示，加标回收率在69.2%～99.8%之间，RSD在0.90%～4.58%之间，表明本方法的准确度良好。
表5 方法的回收试验结果Table 5 Recovery test results of the method
2.5 样品分析
从市场购买10个葡萄酒样品，包括6个‘赤霞珠’干红葡萄酒和4个‘霞多丽’干白葡萄酒。使用新建立的方法对样品中的类黄酮物质进行检测，结果见表6。由表6可知，葡萄酒中检出的化合物有花旗松素、槲皮素、杨梅素、杨梅苷和表儿茶素等13种组分。仅在干红葡萄酒中检出的化合物有槲皮素、杨梅素和山奈酚。所有样品中均未检出芦丁、刺槐苷、表没食子儿茶素没食子酸酯和水仙苷。由此可知，该方法适用于葡萄酒中类黄酮化合物的定性和定量分析。
表6 葡萄酒中类黄酮化合物的测定Table 6 Determination of flavonoid compounds in wine μg·L-1
本文采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了葡萄酒中17项类黄酮化合物含量的测定方法，并对建立的方法进行了方法学验证。结果表明，该方法简便、快速、准确度高、灵敏度好，可以满足葡萄酒中类黄酮物质的准确定性和定量分析。实际样品的分析结果表明，该方法适用于葡萄酒中类黄酮化合物的检测。该方法的建立为进一步加强葡萄酒质量及品质控制提供了科学的方法参考。
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