蔡烨琳，景欣悦，朱丁香，胡化广，张振铭
（盐城师范学院海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224007）
在长期的进化过程中，植物个体进化出两种方式适应干旱胁迫，一种是避旱[1]，某些植物在土壤及其本身发生严重水分亏缺之前完成生活史，如沙漠中某些短命植物只在雨季生长；
另一种更广泛的适应方式是耐旱[2]，通过在干旱时体内物质如渗透调节物质积累，抗氧化保护酶活性的升高，根系的适应性生长等方式适应干旱胁迫。
自然界资源往往呈现斑块状分布，这些资源在空间分布上具有斑块性、梯度性，呈现空间异质性[3]。克隆植物指生长在自然环境中，通过自身的无性繁殖，衍生出多个相同个体，这些个体从外观和生理上具有相似性[4,5]。克隆整合是克隆植物最突出的特性[6]，在面临如干旱[7]、遮阴[8]、盐胁迫[9]、重金属[10]等胁迫环境时，克隆植物相连分株间通过整合机制，实现信息、资源与能量的共享，从而缓解异质性环境胁迫对植物生长和发育造成的不利影响，提高克隆植物对异质环境的适应性[11]。在大多数研究中，发现母株对子株具有生理整合，但子分株对母株没有生理整合[12-14]。然而，一些研究表明，生理整合可以导致库和源之间的关系发生变化，并且存在反馈机制[15,16]。此外，其他研究发现，母株和子株之间没有生理整合[17]。这些研究表明，克隆整合可能存在物种特异性，整合的方向可能会根据不同的植物而改变。
沟叶结缕草（Zoysia matrella）又名马尼拉草，是结缕草属（ZoysiaWilld.）多年生草本植物，分布于中国台湾、广东、海南；
亚洲和大洋洲的热带地区亦有分布。沟叶结缕草通过地下茎和匍匐茎的无性繁殖形成的草坪低矮平整，茎叶纤细美观，又具一定的弹性，加上侵占力强，易形成草皮，所以常栽种于花坛内作封闭式花坛草坪或作草坪造型供人观赏。因其耐践踏性强，也可用作运动场、飞机场及各种娱乐场所的美化植物。在结缕草属植物克隆整合研究上，何月对水分异质性对克隆植物日本结缕草（Zoysia japonica）光合和抗氧化酶的影响进行了研究，发现在水分异质情况下，日本结缕草存在生理整合现象[18]。前人对沟叶结缕草个体适应干旱胁迫的机理进行了一些研究[19-21]，但是在群体上研究的较少，特别是克隆整合在其适应干旱胁迫中的作用还未见报道。本文通过研究水分异质生境下沟叶结缕草分株的生理和生长指标变化，以期揭示克隆植物沟叶结缕草是否存在生理整合及其整合特点，研究结果对于丰富克隆植物生理整合理论，揭示沟叶结缕草群体适应干旱的机理具有非常重要的理论意义；
同时，对于沟叶结缕草的建植和养护管理也具有非常重要的现实意义。
1.1 实验材料和培养
2021年5月，从盐城师范学院生物园选择生长一致的24个沟叶结缕草克隆片段，每个片段带有6个节，基端和顶端分别种在装有河沙的塑料盆中，塑料盆高20 cm，盆口直径15 cm，基质填沙量为塑料盆体积的4/5。植株在室外培养，光照范围为600～1 780 mmol/（m2·s），温度范围为14.3～32.5 °C，平均温度为21.7 °C，相对湿度为73 ±10%，植株每3 d 浇一次水，每周浇灌200 mL 1/2 Hoagland 营养液一次。待基端母株和顶端子株长出足量的叶片后，植株茎叶盖度为盆口面积的90%以上时，开始干旱处理。实验设2个处理，一个为干旱处理，另一个为匍匐茎剪断或者连接处理。干旱设4 个水分水平，母株正常浇水，子株分别处于正常含水量的100%、60%、40%和20%，采用每天称重，补充水分的方法保持土壤含水量恒定。
1.2 生理指标测定方法
胁迫14 d 后，取子株成熟的叶片测定生理指标，包括叶片超氧阴离子产率、过氧化氢含量、丙二醛（MDA）含量和相对电导率（RC）、过氧化氢酶（CAT）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性。具体测定方法如下。
1.2.1 超氧阴离子产率的测定
参照陆巍等[22]人的方法。具体如下：取各处理沟叶结缕草子株叶片0.5 g，然后依次加入3 mL 磷酸缓冲盐溶液、1 mL羟胺溶液、1 mL 0.1 mol/L EDTA，暗环境下冰浴研磨至匀浆。匀浆液在12 000g下离心30 min，吸取1 mL 上清液，依次加入1 mL 对氨基苯磺酸、1 mLα-萘胺溶液后振荡混匀。置于37 ℃下保温10 min，加入3 mL 乙醚并充分混匀，随后将所有混合液在2 000g下离心5 min，吸出上清液后在530 nm 处测其吸光度，然后以亚硝酸钠溶液绘制标准曲线确定超氧阴离子产率。
1.2.2 H2O2含量的测定
参照Loreto 和Velikova 的方法[23]。取各处理沟叶结缕草子株叶片0.5 g，加入5 mL 0.1%(W/V)三氯乙酸冰浴研磨成匀浆。将匀浆在12 000g下离心15 min，取0.5 mL 上清液，加入0.5 mL 10 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）和1 mL 1M 碘化钾，振荡后取混合物在390 nm 处测吸光度，根据标准曲线计算H2O2含量。
1.2.3 MDA含量的测定
采用硫代巴比妥酸法，取各处理子株叶片1.0 g，加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂研磨至匀浆。将匀浆在4 000g下离心10 min，提取上清液保存。吸取2 mL 上清液，与0.6%TBA溶液充分混匀后，置于沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532 nm、600 nm 和450 nm 波长下的吸光度。MDA 浓度计算公式（1）和MDA 含量计算公式（2）如下：式中：C为MDA浓度，μmol/L；
A为吸光度。
式中：Y为MDA 含量，nmol/g；
V为提取液体积，mL；
W为植物组织鲜重，g。
1.2.4 叶片相对电导率的测定
取各处理沟叶结缕草子株叶片1.0 g，用双蒸水冲洗3 次，随后用滤纸将表面水分擦拭干净、剪碎，每处理取0.1 g，分别加入到含10 mL 去离子水的试管中，于室温下加盖浸泡12 h。用电导仪测定提取液电导率（R1），随后用沸水浴加热30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定电导率（R2）。用公式R1/R2×100%计算相对电导率[24]。
1.2.5 酶的提取和活性测定
参照Li 等[25]人的方法，先将0.5 g 的叶片冰浴研磨，然后在3.0 mL 含有0.2 M EDTA 和2%聚乙烯吡咯烷酮（W/V）的50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.8）中匀浆，然后4 °C，12 000g离心20 min，上清液用于酶活性测定。POD、SOD、CAT 活性采用张志忠等[26]人的方法测定，GPX 活性采用张景萍[27]的方法测定。
1.3 生物量测定
生理指标测完后，把沟叶结缕草从盆中取出，用自来水把河沙冲洗干净，把根系和地上部分分开，将水分吸取干净，在105 °C 下杀青15 min，然后在80 ℃烘箱内烘干24 h至恒重，用电子天平测量干重并记录。
1.4 数据分析
实验数据方差分析采用SAS（Version 9.42）软件；
平均值采用Duncan 多重比较法，显著水平P≤0.05；
绘图用Microsoft Excel 2010软件。
2.1 克隆整合对沟叶结缕草子株活性氧及膜完整性的影响
表1 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草活性氧及膜完整性影响的F值Tab.1 F values of water heterogeneity and stolon connection on active oxygen and membrane integrity of Z.matrella.
图1 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草抗氧化胁迫各指标的影响Fig.1 Water heterogeneity and stolon connection on active oxygen and membrane integrity of Z.matrella
2.2 克隆整合对沟叶结缕草子株抗氧化酶活性的影响
叶片CAT、GPX、SOD活性均受水分胁迫、匍匐茎连接与否以及它们互做的极显著的影响，而POD 活性仅受水分胁迫和互做的显著影响，匍匐茎连接状态对POD 活性没有显著影响（表2）。匍匐茎无论断开或者连接，子株CAT 的活性随土壤持水量的下降而显著上升[见图2（a）]，而SOD 活性也呈现相似的变化趋势，不同的是，在匍匐茎连接状态下，60%和40%土壤水分条件下子株叶片SOD 活性无显著差异，在匍匐茎断开的情况下，40%和20%水分条件下，子株叶片的SOD活性也无显著差异[见图2（b）]。在各土壤水分下，匍匐茎连接子株叶片CAT 和SOD 均小于匍匐茎断开子株CAT 和SOD 活性[见图2（a），图2（b）]。子株GPX 和POD 活性随着土壤持水量的下降呈现先上升后下降趋势，在土壤持水量40%时，两种酶的活性达到最大值，然后开始下降，这时，匍匐茎连接和断开子株GPX 活性分别比对照增加了88.81%和149.78%[见图2（c）]，而POD 活性分别增加了454.50%和619.47%[见图2（d）]。在60%和40%土壤持水量情况下，匍匐茎连接子株的GPX 和POD 活性均小于匍匐茎断开子株的GPX 和POD 活性，但是在20%土壤持水量下，无论匍匐茎断开或者连接，子株GPX和POD活性没有显著差异[见图2（c），图2（d）]。
表2 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草抗氧化保护酶活性影响的F值Tab.2 F values of water heterogeneity and stolon connection on antioxidant protective enzymes of Z.matrella.
图2 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草抗氧化酶的影响Fig.2 Water heterogeneity and stolon connection on antioxidant protective enzymes of Z.matrella
2.3 克隆整合对沟叶结缕草形态特征的影响
水分胁迫、匍匐茎连接以及它们的互做显著影响子株的生物量积累，但对母株没有显著的影响，克隆片段的生物量只受水分胁迫和匍匐茎连接的显著影响，但不受互做的影响（表3）。无论匍匐茎连接或者断开，子株和克隆片段的生物量均随着含水量的降低呈现先增加后降低的趋势，子株和克隆片段在土壤含水量60%时生物量最大，显著的高于其他各处理，且匍匐茎连接子株的生物量显著的高于匍匐茎断开子株的生物量（图3）。在100%和40%土壤水分处理下，匍匐茎断开与连接子株和克隆片段的生物量没有显著差异，但在20%的土壤含水量处理下，匍匐茎连接子株和克隆片段的生物量显著的高于匍匐茎断开子株的生物量（图3）。
表3 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草生物量积累和根冠比影响的F值Tab.3 F values of water heterogeneity and stolon connection on biomass accumulation and root/shoot of Z.matrella
图3 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草生物量积累的影响Fig.3 Water heterogeneity and stolon connection on biomass accumulation of Z.matrella
水分胁迫、匍匐茎连接以及他们的互做显著影响子株的根冠比，但是对母株的根冠比没有显著的影响（表3）。无论匍匐茎断开或者连接，子株的根冠比在40%土壤含水量时最大，且匍匐茎断开的根冠比大于匍匐茎连接的根冠比。在100%含水量处理下，子株的根冠比没有显著差异，但是在60%和20%的土壤水分处理下，匍匐茎断开的根冠比均显著大于匍匐茎连接的根冠比（图4）。
图4 水分异质处理和匍匐茎连接对沟叶结缕草生物量积累的影响Fig.4 Water heterogeneity and stolon connection on root/shoot of Z.matrella
注：图中相同小写字母表示子株根冠比无显著差异（P<0.05）。
与非克隆植物相比，克隆整合增加了克隆植物在异质生境下的适应能力[28]。正常生境下，活性氧的产生和清除保持动态平衡，但当植物遭受干旱、淹水、重金属和盐胁迫时，活性氧的产生和清除的平衡被打破，导致活性氧积累。O2－·和H2O2是植物中两种重要的活性氧[29]，在本研究中，水分胁迫诱导过量的O2－·和H2O2产生，并引起O2－·和H2O2的积累，过量的O2－·和H2O2导致膜质过氧化。MDA 是膜脂过氧化的产物[11]，膜质过氧化破坏了细胞膜，导致电解质扩散，导致相对电导率增加，因此O2－·产率、H2O2和MDA 含量和相对电导率可以反映细胞膜的损伤程度。本研究表明，水分异质生境下，沟叶结缕草匍匐茎连接显著降低了子株的O2－·产率和H2O2含量，有匍匐茎连接子株的MDA 含量和相对电导率也低于匍匐茎断开子株的MDA 含量和相对电导率，说明水异质生境下，克隆整合作用减轻了沟叶结缕草子株的氧化损伤。本研究的结果与何月[18]的研究结果不同，何月在研究结缕草水分生理整合时认为无法推断出结缕草母子株在水分异质条件下，是否存在MDA 生理整合，他推测可能为生理整合发生在干旱条件下的单株受到伤害以后，此时单株体内的 MDA 已产生，无法在发生生理整合伤害减轻后自行分解。
APX、GPX、SOD和POD是植物清除活性氧最重要的四种保护酶。抗氧化酶活性的变化已被广泛用作植物抵御逆境伤害的指标，一般来说，抗氧化酶活性与细胞伤害程度呈正相关[30]。本研究表明，在水分异质生境下，4 种抗氧化酶活性显著提高，有匍匐茎连接子株的APX、GPX 和SOD 活性均低于匍匐茎断开子株的APX、GPX 和SOD 活性。胡俊靖等[31]在研究美丽箬竹（Indocalamus decorus）水分生理整合时也发现，与高水势、中水势分株相连的低水势分株叶片抗氧化酶增加明显，且分株间水势差越大，低水势分株抗氧化酶活性变化越明显，抗氧化系统清除活性氧能力越强。景雄[32]在研究毛竹（Phyllostachys edulis）水分生理整合时也发现相同现象。本研究还发现匍匐茎断开或者连接对POD 活性没有显著影响，说明水分异质生境下，沟叶结缕草母株对子株的APX、GPX 和SOD活性有显著的生理整合作用，而对POD无克隆整合作用。
本研究发现克隆整合促进了沟叶结缕草子株和克隆片段的生长，影响了子株的根冠比，但克隆整合没有影响母株的生长，这一结果与他人实验结果一致[33]。原因可能是，一方面，母株在不影响自身生长的情况下将其资源转移到子分株上[34]，另一方面，克隆整合改变了分株间的源库关系，刺激了母株的补偿性生长[33]。李晓霞等[35]人在研究薇甘菊（Mikania micrantha）水分生理整合时发现，水分异质生境下，克隆整合显著提高了低水斑块分株的生物量，这与本文的研究结果相一致；
但是在她的研究中还发现，克隆整合对整个克隆片段的生物量没有影响，并且克隆整合提高了高水斑块分株的根冠比，这与本文的研究结果不同，这可能与克隆整合具有物种特异性有关[36]。
本研究结果表明，异质性水分胁迫下，克隆整合缓解了水分胁迫对沟叶结缕草受胁迫分株的影响，存在着从母株到子株明显的生理整合作用。在水分异质生境下，沟叶结缕草通过匍匐茎或者地下茎实现养分、水分从母株到子株的重新分配，导致受胁迫子株APX、GPX 和SOD 活性增加，从而减轻了水分胁迫造成的沟叶结缕草子株的过氧化损伤，同时促进了沟叶结缕草子株和克隆片段的生长，并提高了子株的根冠比，增加了子株对水分异质生境的适应。
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