盛玉章，骆 汉，谢永生, 3，王渭玲，李 镇，陈东凯
(1.西北农林科技大学水土保持研究所，陕西 杨凌 712100; 2.中国科学院水利部水土保持研究所，陕西 杨凌 712100;3.陕西汉唐农业标准化研究院，陕西 西安 710000; 4.西北农林科技大学化学与药学院，陕西 杨凌 712100;5.中南电力设计院有限公司，湖北 武汉 430071)
秦艽(G.macrophyllaPall.)是龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)多年生草本植物，以根入药，《中国药典》仅将秦艽、麻花艽、粗茎秦艽和小秦艽规定为正品秦艽，其主要药用成分有龙胆苦苷和马钱苷酸等，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热等作用[1]。由于之前对野生秦艽资源保护的缺失以及市场对秦艽需求量的持续增加，野生秦艽资源数量严重不足。陕西、甘肃等秦艽道地产区已经开展了将近30年的秦艽人工种植[2]，但由于秦艽对海拔和环境要求较高以及人工栽培技术的不成熟，品种退化、品质不好[3]等问题难以解决，极大制约了秦艽产业的发展[4]。施肥是人工调控植物营养的重要手段，对于保证中药材产量和品质至关重要[5]，氮、磷、钾是植物生长过程中所需要的大量元素，合理施用可以很好地保证人工栽培中药材产量和有效成分含量。调查表明农民在种植秦艽过程中缺乏科学指导，施肥往往仅重视产量而忽视了其有效成分的积累，导致秦艽品质参差不齐[6]。
有学者研究了施肥对秦艽产量及有效成分的影响，如吴春等[7]发现适当施用磷、钾肥可以促进环烯醚萜的积累，通过“3414”施肥方案筛选出秦艽产量—质量的最优施肥方案为：氮肥21.49～42.03 kg·667m-2，磷肥49.53～65.75 kg·667m-2，钾肥26.34～42.97 kg·667m-2[6]。李向阳等[8]研究发现磷肥和尿素施肥比为4∶1时秦艽叶中龙胆苦苷的含量显著提高。魏莉霞等[9]的研究表明施用尿素、磷二铵和有机肥均能够增加秦艽产量，同时尿素有利于秦艽龙胆苦苷的积累。但目前此类研究仍不够深入，存在试验设计简单、施肥种类单一等问题，因此有必要进一步开展研究。针对秦艽种植中施肥不合理的问题，本试验通过三因素二次D-饱和最优设计进行配方施肥，建立数学模型分析研究不同施用量下氮、磷、钾肥对秦艽产量及其主要药用成分的影响，以探明秦艽的优化施肥模式，为秦艽规范化种植提供理论依据和数据支撑。
1.1 试验区概况
试验区位于陕西省宝鸡市陇县八渡镇桃园村(34°45′11″N，106°52′43″E)，地处关中平原西部，属暖温带大陆性季风气候，年平均气温10.7℃，无霜期200 d，日照时数2 033.3 h，年平均降雨量为600.1 mm。土壤类型为棕壤，选择2019年开始种植秦艽的地块进行试验，播种株行距为0.25 m×0.25 m，施肥和灌溉为当地常规水平。试验开始前使用五点采样法采集0～20、20～40 cm土层土样，风干后过1 mm筛，用电位测定法测定土壤pH，用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量，用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定土壤有效磷含量，用1 mol·L-1NH4OAC浸提-火焰光度法测定土壤速效钾含量，土壤有机质含量用重铬酸钾容量法测定[10]。土壤基础农化性状见表1。
表1 土壤农化性状Table 1 Soil agrochemical traits
1.2 试验设计
供试材料由陕西省宝鸡市陇县八渡镇桃园村药农提供，经西北农林科技大学徐福利教授鉴定为秦艽(G.macrophyllaPall.)。试验于2021年7月13日开始，此时秦艽处于花期，选择植株长势相近的地块共120 m2，采用三因素二次饱和D-最优设计方案设计，以不施肥为空白对照，设10个处理，3次重复，共30个小区，小区面积为4 m2，随机区组排列。试验施肥设计编码值及施肥量见表2。试验开始后，氮肥(尿素，N 46.4%)、磷肥(过磷酸钙，P2O512%)、钾肥(硫酸钾，K2O 51%)一次性施入各小区。生育期全程不灌溉，田间管理同当地。2021年10月31日进行秦艽根的收获及取样。
表2 秦艽施肥设计方案Table 2 Fertilization design scheme of G. macrophylla Pall.
1.3 测定项目和方法
于2021年10月31日将各小区秦艽根全部采挖收获，清水洗净后，用烘箱在55℃下烘干48 h至恒重，各处理分别称重并折算出公顷产量。将烘干后的秦艽根研磨至粉末，过3号筛。取粉末0.2 g置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得待测液，通过高效液相色谱法[3]测定龙胆苦苷、马钱苷酸含量。
1.4 数据分析
使用Excel软件进行数据整理分类，运用SPSS 21进行单因素ANOVA方差分析，DPSv 7.05软件进行线性回归分析，Excel、Matlab进行作图。
2.1 秦艽产量与氮、磷、钾肥效反应模式的建立与检验
以表2中氮(X1)、磷(X2)、钾(X3)编码值为自变量，以表3中秦艽产量(Y1)为因变量进行二次多项式回归，得到肥效方程：
Y1=2115.851+79.005X1+81.069X2-
0.214X3-50.68X12-204.627X22+
78.067X32-0.492X1X2-0.351X1X3+
4.572X2X3
(1)
该方程F检验结果为F=19.602>F0.01(9,20)=3.46，表明回归关系极显著，说明该方程能够很好地反映各施肥量与秦艽产量之间的关系。
2.2 龙胆苦苷、马钱苷酸与氮、磷、钾肥效反应模式的建立与检验
以表2中氮(X1)、磷(X2)、钾(X3)编码值为自变量，以表3中龙胆苦苷含量(Y2)为因变量进行二次多项式回归，得到肥效方程：
表3 氮、磷、钾肥对秦艽产量以及品质的影响Table 3 The effects of N, P and K fertilizationon the yield quality indicators of G. macrophylla Pall.
Y2=7.407+0.393X1+0.57X2-0.025X3-
0.225X12-0.354X22+0.034X32+
0.279X1X2-0.156X1X3-0.105X2X3
(2)
F=53.198>F0.01(9,20)=3.46，表明回归关系极显著，说明该方程能够很好地反映各施肥量与龙胆苦苷含量之间的关系。
同理，马钱苷酸的肥效方程为：
Y3=2.074+0.053X1+0.084X2+0.027X3-
0.036X12-0.132X22-0.119X32+
0.007X1X2-0.001X1X3-0.023X2X3
(3)
F=19.172>F0.01(9,20)=3.46，表明回归关系极显著，说明该方程能够很好地反映各施肥量与马钱苷酸含量之间的关系。
2.3 秦艽产量和主要药用成分效应函数的解析
由于氮、磷、钾肥和秦艽产量及龙胆苦苷、马钱苷酸回归方程中实际施肥量与编码值之间存在线性代换关系，因此各偏回归系数绝对值大小可以直接反映各因子的重要程度。式(1)中氮、磷、钾肥的一次项绝对值系数分别为79.005、81.069、0.214，式(2)中氮、磷、钾肥的一次项绝对值系数分别为0.393、0.570、0.025，式(3)中氮、磷、钾肥的一次项绝对值系数分别为0.053、0.084、0.027。各式中绝对值系数大小规律均表现为：磷肥>氮肥>钾肥，说明磷肥对秦艽产量以及龙胆苦苷、马钱苷酸含量影响最大，氮肥次之，钾肥最小。
2.3.1 氮、磷、钾肥单因素效应分析 使用降维法[11]，将式(1)、式(2)、式(3)中任意2个自变量固定为0，即可分别得到氮、磷、钾肥与秦艽产量、龙胆苦苷含量、马钱苷酸含量的单因子效应方程，根据方程分别作图。
从图1A可以看出，氮、磷的产量单因子效应方程开口向下，而钾的开口向上，氮肥曲线拐点编码值为0.5左右，磷肥和钾肥的曲线拐点编码值均为0左右；
本试验范围内秦艽产量随氮、磷肥施用量的增加先增加后降低，随钾肥施用量的增加先降低后增加。氮、磷的龙胆苦苷含量单因子效应方程开口向下，钾的单因子效应方程开口向上，氮、磷肥曲线的拐点编码值在0.75左右，钾肥的曲线拐点编码值在0.5左右；
在本试验范围内，龙胆苦苷含量随氮肥和磷肥施用量增加先上升后降低，随钾肥施用量的增加先降低后增加，但变化幅度很小(图1B)。氮、磷、钾的马钱苷酸含量单因子效应方程开口均向下，其中，氮肥曲线拐点在1.0左右，磷肥曲线拐点在0.25左右，钾肥曲线拐点在0左右；
试验范围内秦艽马钱苷酸含量均随氮肥施用量的增加而增加，随磷肥和钾肥施用量的增加呈先增加后减少的趋势(图1C)。
图1 氮、磷、钾与秦艽产量(A)、龙胆苦苷含量(B)以及马钱苷酸含量(C)的单因子效应分析Fig.1 Single factor analysis of N, P and K fertilizationon the yield(A), gentiopicroside content(B) and />loganinic acid content (C)of G. macrophylla Pall.
2.3.2 双因素间交互作用分析 本试验建立的秦艽产量以及龙胆苦苷、马钱苷酸含量回归模型中，存在氮磷、氮钾、磷钾交互项，其偏回归系数均达到显著水平，说明氮、磷、钾肥之间存在互作效应，共同对秦艽产量和龙胆苦苷以及马钱苷酸的积累产生了影响。使用降维法将式(1)、式(2)和式(3)中任意一个编码值变为0，研究其余两因素之间的交互作用，并作曲面图(图2)。
由图2A、2D、2G可知，氮磷互作效应中，氮、磷对秦艽产量、龙胆苦苷含量和马钱苷酸含量的交互作用曲面均开口向下。秦艽产量、马钱苷酸含量最小时氮、磷的编码值均为-1，最大时氮的编码值为1，磷的编码值为0，秦艽产量和马钱苷酸含量在氮肥施用量不变的情况下随磷肥施用量的增加先增加后降低，在磷肥施用量不变的情况下随氮肥施用量的增加而略增加。氮、磷对秦艽龙胆苦苷含量的积累具有明显的交互促进作用，龙胆苦苷含量最高时氮、磷的编码值均为1。
由图2B、2E、2H可知，氮钾互作效应中，氮、钾对秦艽产量的交互作用曲面开口向上，对龙胆苦苷和马钱苷酸含量的交互作用曲面开口向下。当氮、钾编码值均为1时秦艽产量达到最大，氮、钾编码值为-1、0时产量最小；
高水平钾肥施用量下氮、钾对秦艽产量的增加具有交互促进作用。龙胆苦苷含量最大时氮、钾的编码值为1、-1；
低水平钾肥施用量下龙胆苦苷含量随钾肥施用量增加而降低，高水平下随钾肥施用量增加而增加。马钱苷酸含量最小时氮、钾的编码值均为-1，最大时氮的编码值为1，钾的编码值为0；
马钱苷酸含量在氮肥施用量不变的情况下随钾肥施用量的增加先增加后降低，在钾肥施用量不变的情况下随氮肥施用量的增加而增加。
由图2C、2F、2I可知，磷钾互作效应中，磷、钾对秦艽产量、龙胆苦苷、马钱苷酸含量的交互作用曲面开口均向下。秦艽产量最大时磷、钾的编码值为0、-1；
当磷肥施用量较低，钾肥施用量较高时，磷、钾对秦艽产量的增加具有明显的交互促进作用，当磷肥、钾肥施用量较高时，磷、钾对秦艽产量的增加表现出交互抑制作用。钾肥的施用对龙胆苦苷含量影响很小，龙胆苦苷含量随磷肥施用量的增加而增加。马钱苷酸含量最大值出现时磷、钾的编码值均为0；
磷、钾肥施用量较低时对马钱苷酸的积累具有交互促进作用，施用量较高时则表现为交互抑制。
2.4 施肥模式寻优
秦艽产量效应函数(式1)的Hessian矩阵各阶顺序主子行列式分别为︱A1︱=-101.36、︱A2︱=4.15×104、︱A3︱=6.48×106，判定矩阵A为不定矩阵，函数为非典型函数，因此采用频率分析法寻优[12]。根据试验结果，选择目标产量大于2 100.0 kg·hm-2的范围为产量优域。当X1取0.213～0.764、X2取-0.086～0.318、X3取-0.385～0.431时，即施氮(N)136.4～198.4 kg·hm-2、磷(P2O5)68.6～98.9 kg·hm-2、钾(K2O)69.2～160.9 kg·hm-2时，秦艽目标产量大于2 100.0 kg·hm-2(表4)。
表4 秦艽产量超过2 100.0 kg·hm-2时的因素取值频率分布Table 4 Frequency distribution of factor values when the yield output of G. macrophylla Pall.exceeds 2 100.0 kg·hm-2
同理，龙胆苦苷含量效应函数(式2)以及马钱苷酸含量效应函数(式3)均为非典型函数，采用频率分析法寻优。龙胆苦苷含量超过7.5%时的施肥量为氮(N)147.2～200.1 kg·hm-2、磷(P2O5)92.6～137.1 kg·hm-2、钾(K2O)58.9～147.5 kg·hm-2(表5)。马钱苷酸含量大于2.0%时的施肥量为氮(N)134.5～185.1 kg·hm-2、磷(P2O5)74.8～113.6 kg·hm-2、钾(K2O)95.8～134.2 kg·hm-2(表6)。
表5 龙胆苦苷含量超过7.5%时的因素取值频率分布Table 5 Frequency distribution of factor values when the gentiopicroside content exceeds 7.5%
表6 马钱苷酸含量超过2.0%时的因素取值分布Table 6 Value distribution of factors when the loganinic acid content exceeds 2.0%
中国药典[1]规定秦艽中龙胆苦苷和马钱苷酸的总含量不低于2.5%，因此在秦艽的种植中应同时保证产量与药用成分含量。结合秦艽产量、龙胆苦苷含量、马钱苷酸含量三者的寻优结果，可以得到秦艽产量、龙胆苦苷含量、马钱苷酸含量的最优施肥区间，结果表明秦艽产量超过2 100.0 kg·hm-2、龙胆苦苷含量超过7.5%、马钱苷酸含量超过2.0%时的施肥区间为氮(N)147.2～185.1 kg·hm-2、磷(P2O5)92.6～98.9 kg·hm-2、钾(K2O)95.8～134.2 kg·hm-2。
氮、磷、钾是植物生长发育所必需的大量营养元素。氮、磷两种元素是植物体内蛋白质和酶的重要组成部分[13]，在中药材有效成分的积累过程中发挥巨大作用，磷、钾会促进中药材根系的生长[14]。龙胆苦苷和马钱苷酸均为环烯醚萜类物质，属于萜类化合物，研究表明异戊二烯为萜类化合物的结构单元，其合成的前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)通过MVA途径和MEP途径合成[15]。合成途径中的底物包括诸如乙酰辅酶A、丙酮酸和磷酸甘油醛以及参与合成的各种酶，氮、磷两种元素作为其原料参与了萜类化合物的合成[16]，钾元素则主要通过渗透调节作用影响秦艽次生代谢过程[17]。因此，在中药材生产过程中合理施用氮、磷、钾肥既可以增加产量又能保证中药材的品质。张青云等[18]、李明等[19]对甘草的研究表明，肥料对甘草产量影响大小分别为：磷>钾>氮，对甘草总黄酮含量影响大小为：磷>氮>钾；
施田田等[20]的研究表明肥料对丹参产量影响的强弱顺序分别为：氮>钾>磷；
胡佳栋等[21]的研究发现肥料对党参产量及党参炔苷影响程度分别为：氮>钾>磷，磷>氮>钾；
王占红等[22]对黄精的研究表明肥料对黄精产量及多糖含量影响强弱分别为：磷>钾>氮，钾>氮>磷。在本研究中氮、磷、钾3种元素对秦艽产量及龙胆苦苷、马钱苷酸含量的影响大小均表现为：磷>氮>钾。与前人结果有所不同，可能与不同植物营养特性差异以及各试验区土壤肥力情况不同有关[8]。
本研究结果表明，施肥处理下秦艽产量、龙胆苦苷、马钱苷酸含量均大于对照(表3)，通过合理配施肥料能够有效提升中药材产量和有效成分含量，王婧等[23]、金冬雪等[24]、赵亚兰等[25]对黄芩、桔梗、党参的研究中也出现相同的结果。对氮、磷、钾的单因素效应分析表明，氮、磷肥对秦艽产量及其有效成分积累的影响大于钾肥，适宜的氮、磷、钾肥施用量对秦艽产量的增长以及药用成分积累具有促进作用。本研究发现氮、磷、钾肥在秦艽生长和有效成分积累过程中具有交互作用，对氮、磷、钾的双因素效应分析表明高水平钾肥施用量下氮、钾，低水平磷肥施用量、高水平钾肥施用量下磷、钾，对秦艽产量的增加具有交互促进作用；
高水平磷、钾肥施用量下，磷、钾对秦艽产量的增加表现出交互抑制作用。氮、磷对龙胆苦苷的积累具有交互促进作用；
磷、钾肥施用量较低时二者对马钱苷酸的积累具有交互促进作用，施用量较高时则表现为交互抑制。李福安等[26]的研究发现在秦艽种植过程中施用适量草木灰、麻渣、尿素、复合肥对其产量以及龙胆苦苷含量的增长具有促进作用，但并未进行深入研究。吴春等[6]通过“3414”试验方案研究了粗茎秦艽质量与产量对施肥的响应，得出最佳N、P2O5、K2O比例为1∶0.33～0.85∶0.50～1.60。曾羽等[27]研究了农家肥、草木灰、过磷酸钙3种底肥对秦艽产量及品质的影响，结果表明农家肥2 000 kg·667m-2，过磷酸钙20 kg·667m-2，草木灰100 kg·667m-2作为底肥时秦艽产量和品质最好。本试验条件下秦艽产量超过2 100.0 kg·hm-2、龙胆苦苷含量超过7.5%、马钱苷酸含量超过2.0%时的施肥区间为氮(N)147.2～185.1 kg·hm-2、磷(P2O5)92.6～98.9 kg·hm-2、钾(K2O)95.8～134.2 kg·hm-2，N、P2O5、K2O的最佳配施比例为1∶1.49～2.00∶1.10～1.93。道地药材是指生长在特定自然条件、生态环境的地域，通过特定生产过程所产的药材较其他地区所产的同种药材品质更佳，疗效更好[28]，气候、土壤因素对于中药材的产量和品质影响很大，因此本试验通过寻优得到的最佳施肥方案在实际应用过程中应根据当地自然环境条件进行相应调整。
1)氮、磷、钾3种元素对秦艽产量以及龙胆苦苷、马钱苷酸含量的影响表现为：磷>氮>钾。
2)适宜的氮肥、磷肥施用量可以增加秦艽产量以及龙胆苦苷和马钱苷酸含量，而施用量过高则会产生抑制作用；
钾肥对马钱苷酸的影响和氮、磷肥相同，但钾肥的施用不利于秦艽龙胆苦苷的积累。
3)在关中平原地区，本试验条件下秦艽产量超过2 100.0 kg·hm-2、龙胆苦苷含量超过7.5%、马钱苷酸含量超过2.0%时的施肥区间为氮(N)147.2～185.1 kg·hm-2、磷(P2O5)92.6～98.9 kg·hm-2、钾(K2O)95.82～134.2 kg·hm-2，N、P2O5、K2O的最佳比例为1∶1.49～2.00∶1.10～1.93。
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